Помощь студентам в учебе
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГИДРОКСИЛЬНЫХ РАДИКАЛОВ В КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУРАХ МЕТОДОМ ИМПЕДАНСНОЙ СПЕКТРОСКОПИИ
|
Введение 5
Глава 1 Литературный обзор 11
1.1 Активные формы кислорода в организме человека: механизмы образования
и влияние на живые системы 11
1.2 Гидроксильные радикалы в биологических системах 15
1.2.1 Образование гидроксильных радикалов в живых организмах 15
1.2.2 Вклад гидроксильных радикалов в окислительный стресс 17
1.3 Антиоксидантная защита организма 20
1.3.1 Ферментативные и неферментативные компоненты антиоксидантной
системы 20
1.3.2 Антиоксидантные препараты 23
1.4 Методы определения гидроксильных радикалов в биологических объектах 26
1.4.1 Спектроскопические методы 26
1.4.2 Люминесцентные методы 28
1.4.3 Хроматографические методы 30
1.4.4 Электрохимические методы 31
1.5 Методы определения активности антиоксидантов в биологических объектах
38
1.5.1 Спектроскопические методы 39
1.5.2 Люминесцентные методы 41
1.5.3 Электрохимические методы 42
1.6 Обоснование цели работы 44
Глава 2 Экспериментальная часть 47
2.1 Реагенты, химическая посуда, растворы 47
2.2 Приборы и оборудование 51
2.3 Методика модификации электродов органическими соединениями серы .... 54
2.4 Пробоподготовка клеточных культур 55
2.5 Статистическая обработка данных 56
Глава 3 Влияние органических соединений серы на аналитический сигнал гидроксильных радикалов 57
3.1 Влияние модификатора и параметров регистрации на определение
гидроксильных радикалов 57
3.2 Исследование свойств поверхности сенсоров различными физико -
химическими методами 67
3.2.1 Исследование токопроводящих свойств модифицированного электрода 67
3.2.2 Исследование морфологии поверхности 81
3.3 Подбор рабочих условий определения гидроксильных радикалов 88
3.4 Аналитические характеристики сенсоров с включением органических
соединений серы для определения гидроксильных радикалов 95
Глава 4 Разработка методики количественного определения гидроксильных радикалов в клеточных культурах 99
4.1 Оценка адекватности модели градуировочной зависимости 99
4.2 Исследование мешающего влияния компонентов реальных объектов 102
4.3 Методика определения гидроксильных радикалов в клеточных культурах с
помощью АЦЦ/Аи/ИГЭ 104
4.4 Оценка правильности методики определения гидроксильных радикалов в
клеточных культурах с использованием АЦЦ/ Au/ИГЭ 107
4.5 Метрологические характеристики методики определения гидроксильных
радикалов в клеточных культурах с помощью АЦЦ/ Au/ИГЭ 107
Глава 5 Исследование активности антиоксидантов по отношению к гидроксильным радикалам с использованием нового импедансометрического сенсора 111
5.1 Оценка активности некоторых антиоксидантов в модельном растворе 111
5.2 Оценка активности антиоксидантов по отношению к гидроксильным
радикалам в экстрактах растений 117
5.3 Оценка активности антиоксидантов по отношению к гидроксильным
радикалам в клеточных культурах 118
Заключение 121
Список обозначений и сокращений 123
Список литературы 125
Приложение А Расчет метрологических характеристик методики определения гидроксильных радикалов в клеточных культурах 141
Глава 1 Литературный обзор 11
1.1 Активные формы кислорода в организме человека: механизмы образования
и влияние на живые системы 11
1.2 Гидроксильные радикалы в биологических системах 15
1.2.1 Образование гидроксильных радикалов в живых организмах 15
1.2.2 Вклад гидроксильных радикалов в окислительный стресс 17
1.3 Антиоксидантная защита организма 20
1.3.1 Ферментативные и неферментативные компоненты антиоксидантной
системы 20
1.3.2 Антиоксидантные препараты 23
1.4 Методы определения гидроксильных радикалов в биологических объектах 26
1.4.1 Спектроскопические методы 26
1.4.2 Люминесцентные методы 28
1.4.3 Хроматографические методы 30
1.4.4 Электрохимические методы 31
1.5 Методы определения активности антиоксидантов в биологических объектах
38
1.5.1 Спектроскопические методы 39
1.5.2 Люминесцентные методы 41
1.5.3 Электрохимические методы 42
1.6 Обоснование цели работы 44
Глава 2 Экспериментальная часть 47
2.1 Реагенты, химическая посуда, растворы 47
2.2 Приборы и оборудование 51
2.3 Методика модификации электродов органическими соединениями серы .... 54
2.4 Пробоподготовка клеточных культур 55
2.5 Статистическая обработка данных 56
Глава 3 Влияние органических соединений серы на аналитический сигнал гидроксильных радикалов 57
3.1 Влияние модификатора и параметров регистрации на определение
гидроксильных радикалов 57
3.2 Исследование свойств поверхности сенсоров различными физико -
химическими методами 67
3.2.1 Исследование токопроводящих свойств модифицированного электрода 67
3.2.2 Исследование морфологии поверхности 81
3.3 Подбор рабочих условий определения гидроксильных радикалов 88
3.4 Аналитические характеристики сенсоров с включением органических
соединений серы для определения гидроксильных радикалов 95
Глава 4 Разработка методики количественного определения гидроксильных радикалов в клеточных культурах 99
4.1 Оценка адекватности модели градуировочной зависимости 99
4.2 Исследование мешающего влияния компонентов реальных объектов 102
4.3 Методика определения гидроксильных радикалов в клеточных культурах с
помощью АЦЦ/Аи/ИГЭ 104
4.4 Оценка правильности методики определения гидроксильных радикалов в
клеточных культурах с использованием АЦЦ/ Au/ИГЭ 107
4.5 Метрологические характеристики методики определения гидроксильных
радикалов в клеточных культурах с помощью АЦЦ/ Au/ИГЭ 107
Глава 5 Исследование активности антиоксидантов по отношению к гидроксильным радикалам с использованием нового импедансометрического сенсора 111
5.1 Оценка активности некоторых антиоксидантов в модельном растворе 111
5.2 Оценка активности антиоксидантов по отношению к гидроксильным
радикалам в экстрактах растений 117
5.3 Оценка активности антиоксидантов по отношению к гидроксильным
радикалам в клеточных культурах 118
Заключение 121
Список обозначений и сокращений 123
Список литературы 125
Приложение А Расчет метрологических характеристик методики определения гидроксильных радикалов в клеточных культурах 141
Актуальность работы. Восстановление кислорода в организме человека протекает в несколько стадий, одной из которых является образование гидроксильных радикалов, которые представляют собой крайне
реакционноспособную активную форму кислорода, способную нарушить нормальный метаболизм жизнедеятельности клеток. Так, гидроксильные радикалы вызывают окислительную модификацию нуклеотидов и нуклеиновых кислот, особенно ДНК. OH-радикалы также способствуют перекисному окислению липидов и окислению белков. Лавинообразный рост количества гидроксильных радикалов приводит к окислительному стрессу организма, который является значимым процессом в развитии ряда патологий, таких как нейродегенеративные и сердечно-сосудистые заболевания. Убедительные данные свидетельствуют также о связи окислительного стресса и раковых заболеваний.
Поскольку гидроксильные радикалы являются наиболее опасными и реакционными продуктами неполного восстановления кислорода, они по праву могут считаться одним из основных маркеров окислительного стресса в биологических системах. В этой связи оценка генерации OH-радикалов такими объектами, как живые клетки, имеет большое значение для медицинских и аналитических исследований как с точки зрения понимания фундаментальных свободнорадикальных процессов, так и для оценки эффективности антиоксидантной терапии. Однако мониторинг гидроксильных радикалов в клеточных культурах все еще представляет определенную сложность для исследователей, что связано со сверхкоротким временем свободного существования гидроксильного радикала около 10-9 с и крайне низкими его концентрациями в биологических системах на уровне наномоль/дм3.
Спектроскопия электронного парамагнитного резонанса и
хроматографические методы - классические подходы определения OH-радикалов, позволяют достичь крайне низкого предела обнаружения данных частиц, однако являются методами, требующими использования радикальных ловушек. Помимо этого, данные подходы тяжело приспособить для анализа клеточных культур.
Метод флуориметрии может показаться более привлекательным ввиду возможности визуализировать распределение OH-радикалов внутри клеток, однако существует опасность разрушения биологических образцов под действием излучения в процессе измерений. Флуориметрический подход также предполагает использование радикальных ловушек, что усложняет измерение в случае неполного протекания реакции между радикальной ловушкой и OH-радикалом.
На данный момент электрохимическое определение OH-радикалов в живых клетках является перспективным направлением вследствие использования простого оборудования и быстроты анализа в совокупности с высокой чувствительностью и селективностью. Использование специальных модификаторов, селективно взаимодействующих с гидроксильными радикалами, позволяет не только избежать дополнительного связывания OH-радикалов с радикальными ловушками, но и проводить его прямое количественное определение в биологических объектах. В качестве модификаторов электродной поверхности в основном используются органические соединения серы, а создание микро- и наносенсоров на их основе позволяет проводить внутриклеточное определение OH-радикалов. Помимо этого, применение недеструктивного метода электрохимической импедансной спектроскопии для анализа гидроксильных радикалов позволяет увеличить чувствительность определения и избежать повреждения модификатора на поверхности электрода, возникающего при использовании других электрохимических подходов.
Таким образом, данное исследование направлено на создание нового подхода количественного определения OH-радикалов, продуцируемых живыми клетками, на основе сенсоров, модифицированных органическими соединениями серы, с помощью метода электрохимической импедансной спектроскопии. Данный подход позволяет достичь высокой селективности и чувствительности определения гидроксильных радикалов, что особенно важно для анализа биологических объектов.
Цель и задачи исследования. Цель работы заключается в разработке нового подхода для определения гидроксильных радикалов в клеточных культурах с использованием импедансометрического сенсора на основе серосодержащих органических соединений и оценки активности антиоксидантов по отношению к OH-радикалам в природных и биологических объектах.
Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:
- Исследовать влияние органических соединений серы на получение аналитического сигнала OH-радикалов методом электрохимической импедансной спектроскопии и провести оценку морфологии поверхности сенсора на разных этапах модификации;
- Осуществить подбор рабочих условий определения гидроксильных радикалов методом электрохимической импедансной спектроскопии;
- Разработать методику количественного определения гидроксильных радикалов в клеточных культурах и провести оценку основных метрологических характеристик разработанной методики;
- Исследовать активность антиоксидантов по отношению к гидроксильным радикалам с помощью нового импедансометрического сенсора в модельной системе и клеточных культурах.
Научная новизна работы.
1. Впервые исследовано влияние органических соединений серы на получение аналитического сигнала OH-радикалов методом электрохимической импедансной спектроскопии. Показано, что импрегнированный графитовый электрод, модифицированный электрохимически осажденным золотом и самоорганизующимся монослоем N-ацетил-Ь-цистеина, дает лучшие результаты селективного количественного определения OH-радикалов в биологических объектах. Проведена оценка морфологии поверхности электрода на каждом этапе модификации методом сканирующей электронной микроскопии.
2. Разработан новый подход количественного определения внеклеточных OH-радикалов, генерируемых живыми клетками PC-3 (аденокарцинома простаты) и 3T3-L1 (эмбриональные фибробласты мыши), отличающийся быстротой анализа, селективностью, высокой чувствительностью и отсутствием необходимости использовать радикальные ловушки.
3. Впервые показана возможность использования импрегнированного графитового электрода, модифицированного электрохимически осажденным золотом и самоорганизующимся монослоем N-ацетил-Ь-цистеина, в качестве сенсорной платформы для определения активности антиоксидантов (глутатион, аскорбиновая кислота) по отношению к гидроксильным радикалам, продуцируемым в опухолевых клетках PC-3 (аденокарцинома простаты), A-431 (эпидермоидная карцинома) и U-87 (глиобластома), что позволяет рекомендовать данный подход для мониторинга антиоксидантной терапии пациентов в состоянии окислительного стресса.
Теоретическая и практическая значимость. Теоретическая значимость исследования заключается в получении новых научных знаний о взаимодействии органических соединений серы с гидроксильными радикалами, что дало основу для создания нового аналитического подхода селективного определения OH- радикалов в клеточных культурах. Практическая значимость работы заключается в разработке и использовании новой методики для экспресс-диагностики уровня гидроксильных радикалов в биологических объектах при индуцировании окислительного стресса, что особенно актуально для медицинских исследований в области радикальных процессов, а также в возможности оценки активности различных антиоксидантов по отношению к OH-радикалам, генерируемыми клеточными культурами.
Личный вклад автора. Заключается в сборе, анализе и обработке литературных данных по предложенным ранее подходам для количественного определения гидроксильных радикалов в клеточных культурах и способам оценки активности антиоксидантов, выполнение экспериментальной части работы, а также в публикации полученных результатов в виде тезисов и статей.
Положения, выносимые на защиту.
1. Результаты исследования влияния органических соединений серы на получение аналитического сигнала OH-радикалов методом электрохимической импедансной спектроскопии. Оценка морфологии поверхности сенсора на разных этапах модификации физико-химическими методами;
2. Рабочие условия определения внеклеточных OH-радикалов,
генерируемых живыми клетками, с помощью нового импедансометрического сенсора, отличающегося высокой чувствительностью и селективностью определения. Метрологические характеристики методики определения OH- радикалов в биологических объектах.
3. Способ оценки активности антиоксидантов по отношению к гидроксильным радикалам, применимый как для исследований модельных растворов антиоксидантов, так и для живых клеток.
Степень достоверности и апробация результатов. Основные результаты исследовательской работы были представлены на следующих мероприятиях: XXII Международная научно-практическая конференция студентов и молодых ученых имени выдающихся химиков Л.П. Кулёва и Н.М. Кижнера «Химия и химическая технология в XXI» (Томск, 2021); XI Всероссийская научная конференция и школа «Аналитика Сибири и Дальнего Востока» (Новосибирск, 2021); 12th
International Conference on Instrumental Methods of Analysis, IMA-2021 (Thessaloniki, Greece, 2021); ХХУ Всероссийская конференция молодых ученых- химиков (Нижний Новгород, 2022); XXIII Международная научно-практическая конференция студентов и молодых ученых имени выдающихся химиков Л.П. Кулёва и Н.М. Кижнера «Химия и химическая технология в XXI» (Томск, 2022); Всероссийская конференция с международным участием «Свободные радикалы и антиоксиданты в химии, биологии и медицине» (Новосибирск, 2022); IV Съезд аналитиков России (Москва, 2022); VI Международная научно-практическая конференция «Современные синтетические методологии для создания лекарственных препаратов и функциональных материалов» (Екатеринбург, 2022); XXIV Международная научно-практическая конференция студентов и молодых ученых имени выдающихся химиков Л.П. Кулёва и Н.М. Кижнера «Химия и химическая технология в XXI» (Томск, 2023); XI Всероссийская конференция по электрохимическим методам анализа «ЭМА-2024» (Екатеринбург, 2024); XXV Юбилейная Международная научно-практическая конференция студентов и молодых ученых имени выдающихся химиков Л.П. Кулёва и Н.М. Кижнера «Химия и химическая технология в XXI веке» (Томск, 2024).
Публикации. Результаты проведенных исследований отражены в 16 печатных работах, из которых 4 статьи в научных журналах, которые индексируются базами Web of Science и Scopus, а также 12 тезисов докладов на всероссийских и международных конференциях.
Структура и объем работы. Диссертационная работа выполнена на 151 странице текста компьютерной верстки и включает 34 рисунка, 50 таблиц и список литературы из 151 наименования.
Благодарности. Автор выражает искреннюю благодарность своему научному руководителю, д.х.н., профессору ОХИ ИШПР ТПУ Коротковой Елене Ивановне за всестороннюю помощь на всех этапах выполнения диссертации. Автор благодарит к.х.н., доцента ОХИ ИШПР ТПУ Дорожко Елену Владимировну за помощь в обсуждении экспериментальных данных. Автор выражает признательность к.х.н., доценту ИШХБМТ ТПУ Плотникову Евгению Владимировичу за помощь в работе с клеточными культурами, а также к.ф.-м.н., научному сотруднику ИФПМ СО РАН Семину Виктору Олеговичу за помощь в выполнении исследований по микроскопии. Автор также благодарит своих коллег за помощь и поддержку при выполнении диссертационной
реакционноспособную активную форму кислорода, способную нарушить нормальный метаболизм жизнедеятельности клеток. Так, гидроксильные радикалы вызывают окислительную модификацию нуклеотидов и нуклеиновых кислот, особенно ДНК. OH-радикалы также способствуют перекисному окислению липидов и окислению белков. Лавинообразный рост количества гидроксильных радикалов приводит к окислительному стрессу организма, который является значимым процессом в развитии ряда патологий, таких как нейродегенеративные и сердечно-сосудистые заболевания. Убедительные данные свидетельствуют также о связи окислительного стресса и раковых заболеваний.
Поскольку гидроксильные радикалы являются наиболее опасными и реакционными продуктами неполного восстановления кислорода, они по праву могут считаться одним из основных маркеров окислительного стресса в биологических системах. В этой связи оценка генерации OH-радикалов такими объектами, как живые клетки, имеет большое значение для медицинских и аналитических исследований как с точки зрения понимания фундаментальных свободнорадикальных процессов, так и для оценки эффективности антиоксидантной терапии. Однако мониторинг гидроксильных радикалов в клеточных культурах все еще представляет определенную сложность для исследователей, что связано со сверхкоротким временем свободного существования гидроксильного радикала около 10-9 с и крайне низкими его концентрациями в биологических системах на уровне наномоль/дм3.
Спектроскопия электронного парамагнитного резонанса и
хроматографические методы - классические подходы определения OH-радикалов, позволяют достичь крайне низкого предела обнаружения данных частиц, однако являются методами, требующими использования радикальных ловушек. Помимо этого, данные подходы тяжело приспособить для анализа клеточных культур.
Метод флуориметрии может показаться более привлекательным ввиду возможности визуализировать распределение OH-радикалов внутри клеток, однако существует опасность разрушения биологических образцов под действием излучения в процессе измерений. Флуориметрический подход также предполагает использование радикальных ловушек, что усложняет измерение в случае неполного протекания реакции между радикальной ловушкой и OH-радикалом.
На данный момент электрохимическое определение OH-радикалов в живых клетках является перспективным направлением вследствие использования простого оборудования и быстроты анализа в совокупности с высокой чувствительностью и селективностью. Использование специальных модификаторов, селективно взаимодействующих с гидроксильными радикалами, позволяет не только избежать дополнительного связывания OH-радикалов с радикальными ловушками, но и проводить его прямое количественное определение в биологических объектах. В качестве модификаторов электродной поверхности в основном используются органические соединения серы, а создание микро- и наносенсоров на их основе позволяет проводить внутриклеточное определение OH-радикалов. Помимо этого, применение недеструктивного метода электрохимической импедансной спектроскопии для анализа гидроксильных радикалов позволяет увеличить чувствительность определения и избежать повреждения модификатора на поверхности электрода, возникающего при использовании других электрохимических подходов.
Таким образом, данное исследование направлено на создание нового подхода количественного определения OH-радикалов, продуцируемых живыми клетками, на основе сенсоров, модифицированных органическими соединениями серы, с помощью метода электрохимической импедансной спектроскопии. Данный подход позволяет достичь высокой селективности и чувствительности определения гидроксильных радикалов, что особенно важно для анализа биологических объектов.
Цель и задачи исследования. Цель работы заключается в разработке нового подхода для определения гидроксильных радикалов в клеточных культурах с использованием импедансометрического сенсора на основе серосодержащих органических соединений и оценки активности антиоксидантов по отношению к OH-радикалам в природных и биологических объектах.
Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:
- Исследовать влияние органических соединений серы на получение аналитического сигнала OH-радикалов методом электрохимической импедансной спектроскопии и провести оценку морфологии поверхности сенсора на разных этапах модификации;
- Осуществить подбор рабочих условий определения гидроксильных радикалов методом электрохимической импедансной спектроскопии;
- Разработать методику количественного определения гидроксильных радикалов в клеточных культурах и провести оценку основных метрологических характеристик разработанной методики;
- Исследовать активность антиоксидантов по отношению к гидроксильным радикалам с помощью нового импедансометрического сенсора в модельной системе и клеточных культурах.
Научная новизна работы.
1. Впервые исследовано влияние органических соединений серы на получение аналитического сигнала OH-радикалов методом электрохимической импедансной спектроскопии. Показано, что импрегнированный графитовый электрод, модифицированный электрохимически осажденным золотом и самоорганизующимся монослоем N-ацетил-Ь-цистеина, дает лучшие результаты селективного количественного определения OH-радикалов в биологических объектах. Проведена оценка морфологии поверхности электрода на каждом этапе модификации методом сканирующей электронной микроскопии.
2. Разработан новый подход количественного определения внеклеточных OH-радикалов, генерируемых живыми клетками PC-3 (аденокарцинома простаты) и 3T3-L1 (эмбриональные фибробласты мыши), отличающийся быстротой анализа, селективностью, высокой чувствительностью и отсутствием необходимости использовать радикальные ловушки.
3. Впервые показана возможность использования импрегнированного графитового электрода, модифицированного электрохимически осажденным золотом и самоорганизующимся монослоем N-ацетил-Ь-цистеина, в качестве сенсорной платформы для определения активности антиоксидантов (глутатион, аскорбиновая кислота) по отношению к гидроксильным радикалам, продуцируемым в опухолевых клетках PC-3 (аденокарцинома простаты), A-431 (эпидермоидная карцинома) и U-87 (глиобластома), что позволяет рекомендовать данный подход для мониторинга антиоксидантной терапии пациентов в состоянии окислительного стресса.
Теоретическая и практическая значимость. Теоретическая значимость исследования заключается в получении новых научных знаний о взаимодействии органических соединений серы с гидроксильными радикалами, что дало основу для создания нового аналитического подхода селективного определения OH- радикалов в клеточных культурах. Практическая значимость работы заключается в разработке и использовании новой методики для экспресс-диагностики уровня гидроксильных радикалов в биологических объектах при индуцировании окислительного стресса, что особенно актуально для медицинских исследований в области радикальных процессов, а также в возможности оценки активности различных антиоксидантов по отношению к OH-радикалам, генерируемыми клеточными культурами.
Личный вклад автора. Заключается в сборе, анализе и обработке литературных данных по предложенным ранее подходам для количественного определения гидроксильных радикалов в клеточных культурах и способам оценки активности антиоксидантов, выполнение экспериментальной части работы, а также в публикации полученных результатов в виде тезисов и статей.
Положения, выносимые на защиту.
1. Результаты исследования влияния органических соединений серы на получение аналитического сигнала OH-радикалов методом электрохимической импедансной спектроскопии. Оценка морфологии поверхности сенсора на разных этапах модификации физико-химическими методами;
2. Рабочие условия определения внеклеточных OH-радикалов,
генерируемых живыми клетками, с помощью нового импедансометрического сенсора, отличающегося высокой чувствительностью и селективностью определения. Метрологические характеристики методики определения OH- радикалов в биологических объектах.
3. Способ оценки активности антиоксидантов по отношению к гидроксильным радикалам, применимый как для исследований модельных растворов антиоксидантов, так и для живых клеток.
Степень достоверности и апробация результатов. Основные результаты исследовательской работы были представлены на следующих мероприятиях: XXII Международная научно-практическая конференция студентов и молодых ученых имени выдающихся химиков Л.П. Кулёва и Н.М. Кижнера «Химия и химическая технология в XXI» (Томск, 2021); XI Всероссийская научная конференция и школа «Аналитика Сибири и Дальнего Востока» (Новосибирск, 2021); 12th
International Conference on Instrumental Methods of Analysis, IMA-2021 (Thessaloniki, Greece, 2021); ХХУ Всероссийская конференция молодых ученых- химиков (Нижний Новгород, 2022); XXIII Международная научно-практическая конференция студентов и молодых ученых имени выдающихся химиков Л.П. Кулёва и Н.М. Кижнера «Химия и химическая технология в XXI» (Томск, 2022); Всероссийская конференция с международным участием «Свободные радикалы и антиоксиданты в химии, биологии и медицине» (Новосибирск, 2022); IV Съезд аналитиков России (Москва, 2022); VI Международная научно-практическая конференция «Современные синтетические методологии для создания лекарственных препаратов и функциональных материалов» (Екатеринбург, 2022); XXIV Международная научно-практическая конференция студентов и молодых ученых имени выдающихся химиков Л.П. Кулёва и Н.М. Кижнера «Химия и химическая технология в XXI» (Томск, 2023); XI Всероссийская конференция по электрохимическим методам анализа «ЭМА-2024» (Екатеринбург, 2024); XXV Юбилейная Международная научно-практическая конференция студентов и молодых ученых имени выдающихся химиков Л.П. Кулёва и Н.М. Кижнера «Химия и химическая технология в XXI веке» (Томск, 2024).
Публикации. Результаты проведенных исследований отражены в 16 печатных работах, из которых 4 статьи в научных журналах, которые индексируются базами Web of Science и Scopus, а также 12 тезисов докладов на всероссийских и международных конференциях.
Структура и объем работы. Диссертационная работа выполнена на 151 странице текста компьютерной верстки и включает 34 рисунка, 50 таблиц и список литературы из 151 наименования.
Благодарности. Автор выражает искреннюю благодарность своему научному руководителю, д.х.н., профессору ОХИ ИШПР ТПУ Коротковой Елене Ивановне за всестороннюю помощь на всех этапах выполнения диссертации. Автор благодарит к.х.н., доцента ОХИ ИШПР ТПУ Дорожко Елену Владимировну за помощь в обсуждении экспериментальных данных. Автор выражает признательность к.х.н., доценту ИШХБМТ ТПУ Плотникову Евгению Владимировичу за помощь в работе с клеточными культурами, а также к.ф.-м.н., научному сотруднику ИФПМ СО РАН Семину Виктору Олеговичу за помощь в выполнении исследований по микроскопии. Автор также благодарит своих коллег за помощь и поддержку при выполнении диссертационной
Предложенная в работе методика количественного определения гидроксильных радикалов в клеточных культурах методом спектроскопии электрохимического импеданса отвечает современным требованиям аналитической химии в стремлении к экспрессности, дешевизне и простоте анализа комплексных биологических объектов.
Созданный импедансометрический сенсор отличается простотой модификации и использованием нетоксичных и доступных химических реагентов в качестве модификаторов, представляющих собой золотохлористоводородную кислоту и N-ацетил-Ь-цистеин. Исследование свойств поверхности сенсора различными физико-химическими методами показало, что предложная конструкция на основе графитового электрода, модифицированного электрохимически осажденным золотом и самоорганизующимся монослоем N- ацетил-Ь-цистеина, является перспективной для проведения измерений концентрации OH-радикалов.
Рабочие условия для определения гидроксильных радикалов с помощью предложенного сенсора включают в себя не только необходимое время генерации OH-радикалов с помощью реакции фотохимического разложения пероксида водорода в течение 15 минут, но и время нанесения самоорганизующегося монослоя (24 часа), а также исходную концентрацию раствора АЦЦ (1-10-2 моль/дм3) для получения наиболее интенсивного аналитического сигнала.
Разработана методика количественного определения гидроксильных радикалов в клеточных культурах, апробированная на двух клеточных линиях: аденокарциноме простаты и эмбриональных фибробластах мыши. Данные, полученные с помощью разработанной методики, убедительно свидетельствуют о повышенном состоянии окислительного стресса в опухолевых клетках. Проведена оценка основных метрологических характеристик разработанной методики: показателя повторяемости, показателя внутрилабораторной прецизионности, показателя правильности и показателя точности. Установлено, что показатель точности не превышает норму точности, вследствие чего полученные метрологические характеристики могут считаться установленными характеристиками погрешности для совокупности результатов анализа, которые были получены по разработанной методике в отдельной лаборатории.
Исследование активности антиоксидантов по отношению к гидроксильным радикалам с помощью нового импедансометрического сенсора в модельной системе показало, что наиболее эффективным антиоксидантом для подавления OH-радикалов может считаться глутатион, поскольку данное вещество демонстрирует наибольший процент ингибирования ОН’. Предложенный подход анализа активности антиоксидантов был апробирован на водных экстрактах пихты сибирской, что показывает возможность применения данного способа для исследования различных экстрактов растений, пищевых продуктов и лекарственных препаратов. Оценка активности аскорбиновой кислоты и глутатиона в опухолевых клетках (аденокарцинома простаты, эпидермоидная карцинома и глиобластома) подтвердила, что серосодержащие соединения наиболее эффективны для ингибирования OH-радикалов, генерируемых живыми клетками.
Таким образом, разработанный подход позволяет решить две основные проблемы, возникающие при исследовании уровня OH-радикалов в биологических образцах. Он позволяет отказаться от использования радикальных ловушек, а также дает возможность проводить определение крайней низких концентраций гидроксильных радикалов. Разработанная методика не только открывает новые возможности для исследования фундаментальных радикальных процессов в клеточных культурах, но и предоставляет возможность проводить оценку антиоксидантной терапии в процессе лечения.
Созданный импедансометрический сенсор отличается простотой модификации и использованием нетоксичных и доступных химических реагентов в качестве модификаторов, представляющих собой золотохлористоводородную кислоту и N-ацетил-Ь-цистеин. Исследование свойств поверхности сенсора различными физико-химическими методами показало, что предложная конструкция на основе графитового электрода, модифицированного электрохимически осажденным золотом и самоорганизующимся монослоем N- ацетил-Ь-цистеина, является перспективной для проведения измерений концентрации OH-радикалов.
Рабочие условия для определения гидроксильных радикалов с помощью предложенного сенсора включают в себя не только необходимое время генерации OH-радикалов с помощью реакции фотохимического разложения пероксида водорода в течение 15 минут, но и время нанесения самоорганизующегося монослоя (24 часа), а также исходную концентрацию раствора АЦЦ (1-10-2 моль/дм3) для получения наиболее интенсивного аналитического сигнала.
Разработана методика количественного определения гидроксильных радикалов в клеточных культурах, апробированная на двух клеточных линиях: аденокарциноме простаты и эмбриональных фибробластах мыши. Данные, полученные с помощью разработанной методики, убедительно свидетельствуют о повышенном состоянии окислительного стресса в опухолевых клетках. Проведена оценка основных метрологических характеристик разработанной методики: показателя повторяемости, показателя внутрилабораторной прецизионности, показателя правильности и показателя точности. Установлено, что показатель точности не превышает норму точности, вследствие чего полученные метрологические характеристики могут считаться установленными характеристиками погрешности для совокупности результатов анализа, которые были получены по разработанной методике в отдельной лаборатории.
Исследование активности антиоксидантов по отношению к гидроксильным радикалам с помощью нового импедансометрического сенсора в модельной системе показало, что наиболее эффективным антиоксидантом для подавления OH-радикалов может считаться глутатион, поскольку данное вещество демонстрирует наибольший процент ингибирования ОН’. Предложенный подход анализа активности антиоксидантов был апробирован на водных экстрактах пихты сибирской, что показывает возможность применения данного способа для исследования различных экстрактов растений, пищевых продуктов и лекарственных препаратов. Оценка активности аскорбиновой кислоты и глутатиона в опухолевых клетках (аденокарцинома простаты, эпидермоидная карцинома и глиобластома) подтвердила, что серосодержащие соединения наиболее эффективны для ингибирования OH-радикалов, генерируемых живыми клетками.
Таким образом, разработанный подход позволяет решить две основные проблемы, возникающие при исследовании уровня OH-радикалов в биологических образцах. Он позволяет отказаться от использования радикальных ловушек, а также дает возможность проводить определение крайней низких концентраций гидроксильных радикалов. Разработанная методика не только открывает новые возможности для исследования фундаментальных радикальных процессов в клеточных культурах, но и предоставляет возможность проводить оценку антиоксидантной терапии в процессе лечения.
