Влияние источников углеродного питания на синтез полимера и состав жирных кислот липидов водородоокисляющих бактерий Cupriavidus
|
Реферат 3
Глава 1. Обзор литературы 6
1.1 Водородные бактерии 6
1.2 Липиды микроорганизмов 7
1.3 Жирные кислоты 10
1.4 Основные характеристики ПГА 15
1.5 Биосинтез ПГА 18
1.6 Cupriavidus eutrophus B-10646, как продуцент ПГА 20
Глава 2. Материалы и методы 25
2.1 Бактериальный штамм, среда и условия роста 25
2.2. Измерение параметров процесса 26
2.3. Анализ ПГА структуры 26
2.4. Анализ молекулярного веса ПГА 27
2.5. Анализ липидов и жирных кислот 27
2.6 Статистика 29
Глава 3. Результаты и обсуждения 30
3.1 Рост и синтез полимера C. eutrophus B-10646 на разных субстратах с
добавлением валериановой кислоты 30
3.2 Рост и синтез полимера C. eutrophus B-10646 на разных субстратах с
добавкой пропионовой кислоты 41
Заключение 46
Список использованной литературы 49
Глава 1. Обзор литературы 6
1.1 Водородные бактерии 6
1.2 Липиды микроорганизмов 7
1.3 Жирные кислоты 10
1.4 Основные характеристики ПГА 15
1.5 Биосинтез ПГА 18
1.6 Cupriavidus eutrophus B-10646, как продуцент ПГА 20
Глава 2. Материалы и методы 25
2.1 Бактериальный штамм, среда и условия роста 25
2.2. Измерение параметров процесса 26
2.3. Анализ ПГА структуры 26
2.4. Анализ молекулярного веса ПГА 27
2.5. Анализ липидов и жирных кислот 27
2.6 Статистика 29
Глава 3. Результаты и обсуждения 30
3.1 Рост и синтез полимера C. eutrophus B-10646 на разных субстратах с
добавлением валериановой кислоты 30
3.2 Рост и синтез полимера C. eutrophus B-10646 на разных субстратах с
добавкой пропионовой кислоты 41
Заключение 46
Список использованной литературы 49
Грам-отрицательные факультативные хемолитотрофные бактерии Cupriavidus eutrophus B-10646 (ранее Hydrogenomonas, Alcaligenes, Ralstonia, Wautersia) являются наиболее перспективными продуцентами полигидроксиалканоатов (ПГА), способные синтезировать полимеры с высоким выходом (до 80-90 %) и различной химической структурой на широком спектре субстратов.
В последние годы показано, что синтез ПГА у бактерий может быть связан с метаболизмом липидов, особенно, если в качестве субстратов используются или длинноцепочечные жирные кислоты, или растительные масла. Проведенный полный геномный сиквинс типового штамма Ralstonia eutrophaН16 свидетельствует, что эти бактерии содержат все гены, необходимые для синтеза жирных кислот de novo, для транспорта свободных жирных кислот внутрь клетки и их мобилизации через ^-окисление. Более того, эти бактерии синтезируют экзогенные липазы, способные деградировать и использовать растительные масла и животные жиры в качестве субстратов для своего роста.
Бактерии R. eutrophaотносятся к наиболее изученным организмам в отношении синтеза ПГА, однако данные по составу липидов и жирных кислот весьма ограничены, несмотря на то, что липидный профиль интенсивно используется в хемотаксономии бактерий, а анализ состава жирных кислот является общепризнанным быстрым методом идентификации видов. Нам известно только несколько работ о составе липидов и жирных кислот водородокисляющих бактерий Hydrogenomonas eutropha H-16 и нескольких штаммов Ralstonia, свидетельствующих о том, что состав липидов и жирных кислот этого организма характерен для грам- отрицательных бактерий. Ранее нами был изучен спектр жирных кислот липидов Alcaligenus eutrophus Z-1 в условиях автотрофного роста и Wautersia eutropha B5786 в режиме активного роста и аккумуляции ПГА на фруктозе и было показано, что в условиях синтеза полимера состав жирных кислот претерпевает существенные изменения за счет усиленного синтеза циклопропановых кислот. Подобные изменения состава жирных кислот были получены при воздействии монооксида углерода на рост и синтез запасных веществ в автотрофной культуре R. eutropha.
Жирные кислоты бактерий являются составляющими компонентами клеточных мембран, которые в первую очередь контактируют и реагируют на все изменения в окружающей среде, поддерживая взаимосвязь между структурой и функцией мембраны, сохраняя оптимальную степень текучести липидных компонентов. Изменения в мембранных липидах R. eutropha H850 могут индуцироваться органическими загрязнителями или природой ростового субстрата у Cupriavidus necator JMP134.
Недавно было показано, что при использовании в качестве субстрата олеиновой кислоты для роста Cupriavidus eutrophus B-10646, происходят существенные изменения в составе жирных кислот липидов цитоплазматической мембраны. Поэтому изучение влияния различных ростовых субстратов на состав липидов этих бактерий в условиях оптимального роста и накопления ПГА представляется нам актуальной задачей. Данные, полученные в таких экспериментах, и могут более четко понять связь липидного и ПГА метаболизма [26].
В последние годы показано, что синтез ПГА у бактерий может быть связан с метаболизмом липидов, особенно, если в качестве субстратов используются или длинноцепочечные жирные кислоты, или растительные масла. Проведенный полный геномный сиквинс типового штамма Ralstonia eutrophaН16 свидетельствует, что эти бактерии содержат все гены, необходимые для синтеза жирных кислот de novo, для транспорта свободных жирных кислот внутрь клетки и их мобилизации через ^-окисление. Более того, эти бактерии синтезируют экзогенные липазы, способные деградировать и использовать растительные масла и животные жиры в качестве субстратов для своего роста.
Бактерии R. eutrophaотносятся к наиболее изученным организмам в отношении синтеза ПГА, однако данные по составу липидов и жирных кислот весьма ограничены, несмотря на то, что липидный профиль интенсивно используется в хемотаксономии бактерий, а анализ состава жирных кислот является общепризнанным быстрым методом идентификации видов. Нам известно только несколько работ о составе липидов и жирных кислот водородокисляющих бактерий Hydrogenomonas eutropha H-16 и нескольких штаммов Ralstonia, свидетельствующих о том, что состав липидов и жирных кислот этого организма характерен для грам- отрицательных бактерий. Ранее нами был изучен спектр жирных кислот липидов Alcaligenus eutrophus Z-1 в условиях автотрофного роста и Wautersia eutropha B5786 в режиме активного роста и аккумуляции ПГА на фруктозе и было показано, что в условиях синтеза полимера состав жирных кислот претерпевает существенные изменения за счет усиленного синтеза циклопропановых кислот. Подобные изменения состава жирных кислот были получены при воздействии монооксида углерода на рост и синтез запасных веществ в автотрофной культуре R. eutropha.
Жирные кислоты бактерий являются составляющими компонентами клеточных мембран, которые в первую очередь контактируют и реагируют на все изменения в окружающей среде, поддерживая взаимосвязь между структурой и функцией мембраны, сохраняя оптимальную степень текучести липидных компонентов. Изменения в мембранных липидах R. eutropha H850 могут индуцироваться органическими загрязнителями или природой ростового субстрата у Cupriavidus necator JMP134.
Недавно было показано, что при использовании в качестве субстрата олеиновой кислоты для роста Cupriavidus eutrophus B-10646, происходят существенные изменения в составе жирных кислот липидов цитоплазматической мембраны. Поэтому изучение влияния различных ростовых субстратов на состав липидов этих бактерий в условиях оптимального роста и накопления ПГА представляется нам актуальной задачей. Данные, полученные в таких экспериментах, и могут более четко понять связь липидного и ПГА метаболизма [26].
Проведено культивирование бактерии C. eutrophus B-10646 в периодической культуре. В качестве углеродного субстрата использовали фруктозу, олеиновую кислоту, смесь олеиновой кислоты с фруктозой и добавками солей валериановой и пропионовой кислот.
В эксперименте с валериановой кислотой:
Потребление фруктозы и олеиновой кислоты при использовании их как единственных источников углерода за 72 ч культивирования бактерий составляло соответственно 17.5 г/л и 9.4 г/л. При совместном использовании фруктозы и олеиновой кислоты потребление фруктозы и олеиновой кислоты составляло соответственно 3.4 и 7.7 г/л.
Добавление валериановой кислоты на 24 час культивирования привело к получению гетерополимера на всех приведенных субстратах, но максимальные значения молекулярной массы полимера, были получены при росте на фруктозе.
Содержание внутриклеточных липидов составляло около 2% от сухой биомассы на всех приведенных субстратах. Качественный состав липидных фракций бактерий также не зависел от используемых субстратов.
Состав жирных кислот липидов цитоплазматической мембраны бактерий существенно менялся в зависимости от субстратов: на фруктозе он характеризовался высоким отношением насыщенных кислот к ненасыщенным более 2.2 за счет преимущественного синтеза пальмитиновой, стеариновой и циклопропановых кислот и низким уровнем моноеновых кислот, представленных пальмитолеиновой и цис-вакценовой кислотами. При выращивании бактерий C. eutrophus B-10646 на олеиновой кислоте или на смеси субстратов отношение насыщенных к ненасыщенным кислотам снижалось до 0.2 и 0.9 соответственно. Эти изменения связаны с увеличение доли моноеновых кислот и снижением синтеза циклопропановых кислот. Основным изомером ненасыщенных кислот была олеиновая кислота, доля которой составила от 30 до 58 % в спектре жирных кислот.
Состав жирных кислот прочносвязанных липидов отличался от экстрагируемых и характеризовался высоким содержанием миристиновой кислоты (до 20 % от суммы ЖК) и длинноцепочечных 3-гидроксикислот (более 50 % от суммы ЖК). Достоверных изменений в составе ЖК липополисахаридов бактерий, выращенных на разных субстратах, не выявлено.
В эксперименте с пропионовой кислотой:
Потребление фруктозы и олеиновой кислоты при использовании их как единственных источников углерода за 72 ч культивирования бактерий составляло соответственно 17.4 г/л и 9.3 г/л. При совместном использовании фруктозы и олеиновой кислоты потребление фруктозы и олеиновой кислоты составляло соответственно 4.5 г/л и 6.0 г/л.
Добавление пропионовой кислоты на 24 час культивирования привело к получению гетерополимера на всех приведенных субстратах, но максимальные значения молекулярной массы полимера были получены при росте на фруктозе.
В составе жирных кислот экстрагируемых липидов бактерий, выращенных на разных субстратах, но с добавлением пропионовой кислоты выявлены те же изменения, что и при использовании валериановой кислоты в качестве ко-субстрата. Отсюда можно сделать вывод, что изменения в составе ЖК экстрагируемых липидов определялся только присутствием в среде олеиновой кислоты и не зависел от ко-субстратов
По результатам проделанной работы были сформулированы следующие выводы:
1. Урожай биомассы и содержание полимера при росте на фруктозе, олеиновой кислоте и смеси фруктозы и олеиновой кислоты с добавлением валериановой или пропионовой кислот были сопоставимы и составляли соответственно 5.7-5.9 г/л и 64-82 % от веса сухой биомассы, соответственно. Добавление индукторов привело к синтезу гетерополимеров с включением 3-ОН-ГВ до 27 мол.% на всех субстратах, не зависимо от используемого ко- субстрата.
2. Вне зависимости, какой субстрат использовался при культивировании, содержание экстрагируемых липидов не менялось и составляло около 2 % на сухую биомассу.
3. Состав ЖК экстрагируемых липидов существенно изменялся в зависимости от использованных субстратов. Основные изменения происходили в присутствии в среде олеиновой кислоты, повышая долю 18:1ш9 в липидах цитоплазматической мембраны до 50 % и выше, но не зависели от ко-субстрата.
4. Состав жирных кислот прочносвязанных липидов отличался от экстрагируемых липидов и характеризовался высоким содержанием миристиновой кислоты и длинноцепочечных 3- гидроксикислот. Достоверных изменений в составе ЖК липополисахаридов бактерий, выращенных на разных субстратах, не выявлено.
В эксперименте с валериановой кислотой:
Потребление фруктозы и олеиновой кислоты при использовании их как единственных источников углерода за 72 ч культивирования бактерий составляло соответственно 17.5 г/л и 9.4 г/л. При совместном использовании фруктозы и олеиновой кислоты потребление фруктозы и олеиновой кислоты составляло соответственно 3.4 и 7.7 г/л.
Добавление валериановой кислоты на 24 час культивирования привело к получению гетерополимера на всех приведенных субстратах, но максимальные значения молекулярной массы полимера, были получены при росте на фруктозе.
Содержание внутриклеточных липидов составляло около 2% от сухой биомассы на всех приведенных субстратах. Качественный состав липидных фракций бактерий также не зависел от используемых субстратов.
Состав жирных кислот липидов цитоплазматической мембраны бактерий существенно менялся в зависимости от субстратов: на фруктозе он характеризовался высоким отношением насыщенных кислот к ненасыщенным более 2.2 за счет преимущественного синтеза пальмитиновой, стеариновой и циклопропановых кислот и низким уровнем моноеновых кислот, представленных пальмитолеиновой и цис-вакценовой кислотами. При выращивании бактерий C. eutrophus B-10646 на олеиновой кислоте или на смеси субстратов отношение насыщенных к ненасыщенным кислотам снижалось до 0.2 и 0.9 соответственно. Эти изменения связаны с увеличение доли моноеновых кислот и снижением синтеза циклопропановых кислот. Основным изомером ненасыщенных кислот была олеиновая кислота, доля которой составила от 30 до 58 % в спектре жирных кислот.
Состав жирных кислот прочносвязанных липидов отличался от экстрагируемых и характеризовался высоким содержанием миристиновой кислоты (до 20 % от суммы ЖК) и длинноцепочечных 3-гидроксикислот (более 50 % от суммы ЖК). Достоверных изменений в составе ЖК липополисахаридов бактерий, выращенных на разных субстратах, не выявлено.
В эксперименте с пропионовой кислотой:
Потребление фруктозы и олеиновой кислоты при использовании их как единственных источников углерода за 72 ч культивирования бактерий составляло соответственно 17.4 г/л и 9.3 г/л. При совместном использовании фруктозы и олеиновой кислоты потребление фруктозы и олеиновой кислоты составляло соответственно 4.5 г/л и 6.0 г/л.
Добавление пропионовой кислоты на 24 час культивирования привело к получению гетерополимера на всех приведенных субстратах, но максимальные значения молекулярной массы полимера были получены при росте на фруктозе.
В составе жирных кислот экстрагируемых липидов бактерий, выращенных на разных субстратах, но с добавлением пропионовой кислоты выявлены те же изменения, что и при использовании валериановой кислоты в качестве ко-субстрата. Отсюда можно сделать вывод, что изменения в составе ЖК экстрагируемых липидов определялся только присутствием в среде олеиновой кислоты и не зависел от ко-субстратов
По результатам проделанной работы были сформулированы следующие выводы:
1. Урожай биомассы и содержание полимера при росте на фруктозе, олеиновой кислоте и смеси фруктозы и олеиновой кислоты с добавлением валериановой или пропионовой кислот были сопоставимы и составляли соответственно 5.7-5.9 г/л и 64-82 % от веса сухой биомассы, соответственно. Добавление индукторов привело к синтезу гетерополимеров с включением 3-ОН-ГВ до 27 мол.% на всех субстратах, не зависимо от используемого ко- субстрата.
2. Вне зависимости, какой субстрат использовался при культивировании, содержание экстрагируемых липидов не менялось и составляло около 2 % на сухую биомассу.
3. Состав ЖК экстрагируемых липидов существенно изменялся в зависимости от использованных субстратов. Основные изменения происходили в присутствии в среде олеиновой кислоты, повышая долю 18:1ш9 в липидах цитоплазматической мембраны до 50 % и выше, но не зависели от ко-субстрата.
4. Состав жирных кислот прочносвязанных липидов отличался от экстрагируемых липидов и характеризовался высоким содержанием миристиновой кислоты и длинноцепочечных 3- гидроксикислот. Достоверных изменений в составе ЖК липополисахаридов бактерий, выращенных на разных субстратах, не выявлено.