Помощь студентам в учебе
Технологические основы радиофторирования простетических групп для производства фтор-18 радиофармацевтических лекарственных препаратов
|
Общая характеристика работы 4
ГЛАВА 1. Литературный обзор. Технология получения фтор-18-содержащих радиофармацевтических лекарственных препаратов для позитронно-эмиссионной томографии/компьютерной томографии 9
1.1 Метод ПЭТ/КТ 9
1.2 Радионуклиды для ПЭТ 10
1.3 Радиоизотоп фтора-18 13
1.4 Технологии радиофторирования, применяемые для получения РФЛП, содержащих
радиоизотоп фтора-18 13
1.4.1 Технология электрофильного радиофторирования 14
1.4.2 Технология нуклеофильного радиофторирования 20
1.4.3 Альтернативные технологии радиофторирования 27
1.4.4 Автоматизация радиохимического синтеза 31
ГЛАВА 2. Исследовательская часть. Разработка технологии получения химических предшественников для производства фтор-18 радиофармацевтических лекарственных препаратов 35
2.1 Разработка технологии получения простетических групп на основе эфиров го-
иодалифатических карбоновых кислот 35
2.1.1 Модификация оборудования для проведения радиофторирования эфиров го-
иодалифатических карбоновых кислот 37
2.1.2 Подбор оптимального растворителя для радиофторирования эфиров го-
иодалифатических карбоновых кислот 40
2.1.3 Подбор оптимальной температуры и времени радиофторирования 42
2.1.4 Подбор технологии очистки 44
2.1.5 Контроль качества. Определение радиохимической чистоты эфиров ro-[18F]-
фторалифатических карбоновых кислот 47
2.1.6 Радиофторирование гомологичных эфиров го-иодалифатических карбоновых кислот 50
2.1.7 Синтез 6-[1^]-фторгексановой кислоты для получения простетической группы 58
2.1.8 Технология получения бифункциональной простетической группы на основе
сукцинимидных эфиров 61
Выводы к главе 2.1 63
2.2 Разработка технологии получения простетических групп на основе арилбензриодоксолов, как соединений поливалентного иода 65
2.2.1 Технология получения [18Б]-фторнитробензойной кислоты из соединения
поливалентного иода 66
2.2.2 Модификация оборудования для проведения радиофторирования соединений
поливалентного иода 68
2.2.3 Подбор оптимального растворителя для радиофторирования соединений
поливалентного иода 69
2.2.4 Подбор оптимальной температуры и времени радиофторирования 71
2.2.5 Подбор способа очистки. Контроль качества 73
ГЛАВА 3. Экспериментальная часть 78
3.1 Оборудование 78
3.2 Контроль качества 78
3.3 Реактивы и материалы 78
3.4 Алгоритм синтеза на модуле Synthra RN+ в программном обеспечении SynthraView
81
3.5 Методики синтеза эфиров го-[18Г]-фторалифатических карбоновых кислот 82
4.6 Методика получения 2-фторбензойных кислот из иодоксолов 86
ГЛАВА 4. Принципиальные технологические схемы 89
4.1. Спецификация оборудования 89
4.2 Характеристика сырья, реактивов 93
4.3 Описание технологических схем получения [18Б]-содержащих химических
предшественников 95
4.4 Изложение технологического процесса 99
4.2.2.1 Стадии вспомогательного технологического процесса 99
4.2.2.2 Стадии основного технологического процесса (ТП1-ТП8) 102
4.5 Экономический анализ разработанной технологии получения простетических групп . 106
Перечень статей по диссертационной работе 111
Список сокращений и условных обозначений 114
Список литературных источников 116
ГЛАВА 1. Литературный обзор. Технология получения фтор-18-содержащих радиофармацевтических лекарственных препаратов для позитронно-эмиссионной томографии/компьютерной томографии 9
1.1 Метод ПЭТ/КТ 9
1.2 Радионуклиды для ПЭТ 10
1.3 Радиоизотоп фтора-18 13
1.4 Технологии радиофторирования, применяемые для получения РФЛП, содержащих
радиоизотоп фтора-18 13
1.4.1 Технология электрофильного радиофторирования 14
1.4.2 Технология нуклеофильного радиофторирования 20
1.4.3 Альтернативные технологии радиофторирования 27
1.4.4 Автоматизация радиохимического синтеза 31
ГЛАВА 2. Исследовательская часть. Разработка технологии получения химических предшественников для производства фтор-18 радиофармацевтических лекарственных препаратов 35
2.1 Разработка технологии получения простетических групп на основе эфиров го-
иодалифатических карбоновых кислот 35
2.1.1 Модификация оборудования для проведения радиофторирования эфиров го-
иодалифатических карбоновых кислот 37
2.1.2 Подбор оптимального растворителя для радиофторирования эфиров го-
иодалифатических карбоновых кислот 40
2.1.3 Подбор оптимальной температуры и времени радиофторирования 42
2.1.4 Подбор технологии очистки 44
2.1.5 Контроль качества. Определение радиохимической чистоты эфиров ro-[18F]-
фторалифатических карбоновых кислот 47
2.1.6 Радиофторирование гомологичных эфиров го-иодалифатических карбоновых кислот 50
2.1.7 Синтез 6-[1^]-фторгексановой кислоты для получения простетической группы 58
2.1.8 Технология получения бифункциональной простетической группы на основе
сукцинимидных эфиров 61
Выводы к главе 2.1 63
2.2 Разработка технологии получения простетических групп на основе арилбензриодоксолов, как соединений поливалентного иода 65
2.2.1 Технология получения [18Б]-фторнитробензойной кислоты из соединения
поливалентного иода 66
2.2.2 Модификация оборудования для проведения радиофторирования соединений
поливалентного иода 68
2.2.3 Подбор оптимального растворителя для радиофторирования соединений
поливалентного иода 69
2.2.4 Подбор оптимальной температуры и времени радиофторирования 71
2.2.5 Подбор способа очистки. Контроль качества 73
ГЛАВА 3. Экспериментальная часть 78
3.1 Оборудование 78
3.2 Контроль качества 78
3.3 Реактивы и материалы 78
3.4 Алгоритм синтеза на модуле Synthra RN+ в программном обеспечении SynthraView
81
3.5 Методики синтеза эфиров го-[18Г]-фторалифатических карбоновых кислот 82
4.6 Методика получения 2-фторбензойных кислот из иодоксолов 86
ГЛАВА 4. Принципиальные технологические схемы 89
4.1. Спецификация оборудования 89
4.2 Характеристика сырья, реактивов 93
4.3 Описание технологических схем получения [18Б]-содержащих химических
предшественников 95
4.4 Изложение технологического процесса 99
4.2.2.1 Стадии вспомогательного технологического процесса 99
4.2.2.2 Стадии основного технологического процесса (ТП1-ТП8) 102
4.5 Экономический анализ разработанной технологии получения простетических групп . 106
Перечень статей по диссертационной работе 111
Список сокращений и условных обозначений 114
Список литературных источников 116
Актуальность работы
Своевременная диагностика злокачественных новообразований остается одной из наиболее актуальных задач современной медицины, поскольку позволяет своевременно использовать все доступные подходы к лечению онкологических заболеваний. Одним из наиболее чувствительных методов диагностики является позитронно-эмиссионная томография с компьютерной томографией (ПЭТ/КТ), использующая радиофармацевтические лекарственные препараты (РФЛП). Для выявления процесса злокачественных новообразований, определения стадии и распространенности опухолевого процесса в ПЭТ центрах России применяют ограниченное количество РФЛП: [18Б]-фтордезоксиглюкозу (ФДГ, FDG), [ПС]-метионин, [ПС]-холин и [18F]- простат-специфический мембранный антиген ([18F]-PSMA, [18Р]-ПСМА) [1,2]. При этом фтор-18 является наиболее распространенным ПЭТ-радионуклидом так как имеет наибольший период полураспада среди ультракороткоживущих радионуклидов (УКЖР), что позволяет проводить многостадийные радиохимические синтезы РФЛП на его основе и осуществлять транспортировку полученных препаратов.
Несмотря на высокую чувствительность метода, сами используемые РФЛП не проявляют высокую специфичность, поскольку могут накапливаться не только в злокачественных опухолях, но и во всех очагах с высокой метаболической активностью (например, имеющих воспалительный характер). Поэтому в настоящее время активно ведутся работы по созданию РФЛП нового поколения, с более высокой специфичностью [3,4]. В качестве химических предшественников радиоактивной метки могут быть выбраны адресные молекулы, к примеру, пептидные агенты. В то же время для связывания адресных молекул с радиоизотопом используются или линкеры, или простетические группы. Для связывания пептидов с изотопом фтора-18 необходимы простетические группы. Применяемые в настоящее время способы получения таких групп являются сложными и трудоемкими [5,6].
Поэтому возможность применения соединений поливалентного иода и алициклических кетонов для новых способов синтеза простетических групп, применяемых при введении 18F в структуру белков и пептидов, представляет высокий интерес. Таким образом, актуальными являются разработка технологии введения радионуклида фтор-18 в простетические группы для получения таргентных РФЛП.
Цель работы
Целью диссертационного исследования является разработка новых технологий радиосинтеза простетических групп для производства фтор-18- РФЛП для ПЭТ.
Работа включает в себя решение следующих взаимосвязанных задач:
1. На основе ш-иодпроизводных алифатических карбоновых кислот разработать технологию автоматического радиосинтеза эфиров ®-[18F]- фторалифатических карбоновых кислот и сукцинимидного эфира (NHS) 6-[18F]- фторгексановой кислоты - простетических групп для РФЛП.
2. На основе арилиодоксолов разработать технологию автоматического радиосинтеза 2-[1^]-фтор-5-нитробензойную кислоты - простетической группы для радиофторирования адресных молекул пептидной и белковой природы.
3. Разработать технологические схемы автоматического радиосинтеза [ |81;]-11ростетически групп для получения новых высокоселективных РФЛП.
Научная новизна
1. Разработаны новые общие технологические подходы к радиосинтезу сложных эфиров ш-р^-фторалифатических карбоновых кислот как простетических групп, используемых для получения таргетных РФЛП.
2. Впервые разработана технология радиосинтеза простетической группы 2-[1^]-фтор-5-нитро-бензойной кислоты с использованием соединений поливалентного иода - арилбензоиодоксолов.
3. Впервые исследованы особенности технологии радиосинтеза сукцинимидного эфира (NHS) 6-[18Р]-фторгексановой кислоты для реакции ацилирования адресных белков, используемых в качестве векторов доставки РФЛП к опухолевым клеткам.
4. Разработаны технологические схемы автоматического
радиосинтеза ш-[18Р]-фторалифатических карбоновых кислот и 2-[18Р]-фтор-5- нитро-бензойной кислоты.
Практическая значимость
1. Создан алгоритм автоматического радиосинтеза химических
предшественников для производства фтор-18-содержащих
радиофармацевтических лекарственных препаратов для ПЭТ на модуле Synthra RN+ в программном обеспечении SynthraView («Synthra», Германия).
2. Разработана простая технология радиосинтеза сложных эфиров ш- [18Р]-фторалифатических карбоновых кислот с использованием исходных субстратов эфиров ш-иод-замещенных алифатических карбоновых кислот.
3. Предложен простой и эффективный способ автоматического радиосинтеза [18Р]-фторбензойной кислоты как простетической группы с использованием соединений поливалентного иода для радиофторирования.
По результатам работы сформулированы положения, выносимые на защиту:
1. Технология радиосинтеза сложных эфиров [18Р]-
фторалифатических карбоновых кислот и сукцинимидного эфира (NHS) 6-[18Р]- фторгексановой кислоты для производства фтор-18-содержащих таргетных РФЛП.
2. Технология автоматического синтеза 2-[18Р]-фтор-5-нитро- бензойную кислоты как простетической группы для радиофторирования при получении РФЛП.
Достоверность полученных данных
Анализ содержания продуктов фторирования проводился методом тонкослойной хроматографии на силикагеле (радио-ТСХ).
Апробация результатов работы
Результаты работы были представлены в виде устных и стендовых докладов на следующих конференциях:
1. Международная конференция “1st International Conference on Aptamers in Russia 2019” 27-30 августа, 2019, Красноярск.
2. III Международная научно-практическая конференция
"Актуальные проблемы разработки, производства и применения радиофармацевтических препаратов" РАДИОФАРМА-2019, 18-21 июня 2019, г. Москва.
3. Международная конференция 23 Интернациональный симпозиум по радиофармацевтическим наукам (23rd International Symposium on Radiopharmaceutical sciences), 26-31 мая, 2019 г, Китай, Пекин.
4. Международная летняя школа галогенорганической радиохимии
«CAFACHEM 2020», 26-28 августа 2020 г. Virtual Meeting, Лондон,
Великобритания.
5. 24-ый международный симпозиум по радиофармацевтическим наукам /International Symposium on Radiopharmaceutical sciences, «ISRS-2021» Society of Radiopharmaceutical Sciences ISRS-2021Virtual Meeting, May 17-19, 2021, Paris, France.
6. Конгресс молодых ученых «Актуальные вопросы фундаментальной и клинической медицины», 19-20 ноября 2020 г, г. Томск.
7. Международная конференция «Цифровые управляемые лекарства на стыке наук» 18-19 марта 2021 года, г. Красноярск.
8. Международная научно-практическая конференция «Разработка лекарственных средств - традиции и перспективы», 15-16 сентября, 2021 г., Томск.
9. Практическая конференция «РАДИОФАРМА-2021» «Актуальные проблемы разработки, производства и применения радиофармацевтических препаратов», 29 сентября-4 октября 2021 г., г. Переславль-Залесский.
Публикации.
По материалам диссертационной работы опубликовано 12 работ, в т.ч. 3 статьи в международных рецензируемых научных журналах, индексируемых в международных системах цитирования рекомендованных ВАК РФ для публикации диссертационных исследований, 9 тезисов и материалов докладов на международных и российских конференциях.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 4 глав, заключения, списка литературы из 128 наименований. Работа изложена на 129 страницах, содержит 67 рисунков, 17 таблиц.
Благодарности
Автор выражает искреннюю благодарность своему научному руководителю д.х.н. Юсубову М.С. (ИШХБМТ ТПУ); а также д.фарм.н. Ларькиной М.С. (ФГБОУ ВО СибГМУ Минздрава России) и к.х.н. Подрезовой Е.В. (ИШХБМТ ТПУ) за помощь в планировании экспериментов и советы в написании диссертационной работы.
Автор выражает огромную благодарность за помощь в организации экспериментов химику-эксперту Белугину К.В. (ФГБУ ФСНКЦ ФМБА России); провизору-аналитику Липайкину С.Ю. (ФГБУ ФСНКЦ ФМБА России); химику-эксперту Бадмаеву О.Н. (ФГБУ ФСНКЦ ФМБА России); начальнику ЦРХК Токареву Н.А. (ФГБУ ФСНКЦ ФМБА России), а также за предоставленную возможность проведения научного исследования на базе центра ядерной медицины ФГБУ ФСНКЦ ФМБА России директору центра ядерной медицины Чанчикову Н.Г. (ФГБУ ФСНКЦ ФМБА России) и генеральному директору ФГБУ ФСНКЦ ФМБА России Баранкину Б.В.
Своевременная диагностика злокачественных новообразований остается одной из наиболее актуальных задач современной медицины, поскольку позволяет своевременно использовать все доступные подходы к лечению онкологических заболеваний. Одним из наиболее чувствительных методов диагностики является позитронно-эмиссионная томография с компьютерной томографией (ПЭТ/КТ), использующая радиофармацевтические лекарственные препараты (РФЛП). Для выявления процесса злокачественных новообразований, определения стадии и распространенности опухолевого процесса в ПЭТ центрах России применяют ограниченное количество РФЛП: [18Б]-фтордезоксиглюкозу (ФДГ, FDG), [ПС]-метионин, [ПС]-холин и [18F]- простат-специфический мембранный антиген ([18F]-PSMA, [18Р]-ПСМА) [1,2]. При этом фтор-18 является наиболее распространенным ПЭТ-радионуклидом так как имеет наибольший период полураспада среди ультракороткоживущих радионуклидов (УКЖР), что позволяет проводить многостадийные радиохимические синтезы РФЛП на его основе и осуществлять транспортировку полученных препаратов.
Несмотря на высокую чувствительность метода, сами используемые РФЛП не проявляют высокую специфичность, поскольку могут накапливаться не только в злокачественных опухолях, но и во всех очагах с высокой метаболической активностью (например, имеющих воспалительный характер). Поэтому в настоящее время активно ведутся работы по созданию РФЛП нового поколения, с более высокой специфичностью [3,4]. В качестве химических предшественников радиоактивной метки могут быть выбраны адресные молекулы, к примеру, пептидные агенты. В то же время для связывания адресных молекул с радиоизотопом используются или линкеры, или простетические группы. Для связывания пептидов с изотопом фтора-18 необходимы простетические группы. Применяемые в настоящее время способы получения таких групп являются сложными и трудоемкими [5,6].
Поэтому возможность применения соединений поливалентного иода и алициклических кетонов для новых способов синтеза простетических групп, применяемых при введении 18F в структуру белков и пептидов, представляет высокий интерес. Таким образом, актуальными являются разработка технологии введения радионуклида фтор-18 в простетические группы для получения таргентных РФЛП.
Цель работы
Целью диссертационного исследования является разработка новых технологий радиосинтеза простетических групп для производства фтор-18- РФЛП для ПЭТ.
Работа включает в себя решение следующих взаимосвязанных задач:
1. На основе ш-иодпроизводных алифатических карбоновых кислот разработать технологию автоматического радиосинтеза эфиров ®-[18F]- фторалифатических карбоновых кислот и сукцинимидного эфира (NHS) 6-[18F]- фторгексановой кислоты - простетических групп для РФЛП.
2. На основе арилиодоксолов разработать технологию автоматического радиосинтеза 2-[1^]-фтор-5-нитробензойную кислоты - простетической группы для радиофторирования адресных молекул пептидной и белковой природы.
3. Разработать технологические схемы автоматического радиосинтеза [ |81;]-11ростетически групп для получения новых высокоселективных РФЛП.
Научная новизна
1. Разработаны новые общие технологические подходы к радиосинтезу сложных эфиров ш-р^-фторалифатических карбоновых кислот как простетических групп, используемых для получения таргетных РФЛП.
2. Впервые разработана технология радиосинтеза простетической группы 2-[1^]-фтор-5-нитро-бензойной кислоты с использованием соединений поливалентного иода - арилбензоиодоксолов.
3. Впервые исследованы особенности технологии радиосинтеза сукцинимидного эфира (NHS) 6-[18Р]-фторгексановой кислоты для реакции ацилирования адресных белков, используемых в качестве векторов доставки РФЛП к опухолевым клеткам.
4. Разработаны технологические схемы автоматического
радиосинтеза ш-[18Р]-фторалифатических карбоновых кислот и 2-[18Р]-фтор-5- нитро-бензойной кислоты.
Практическая значимость
1. Создан алгоритм автоматического радиосинтеза химических
предшественников для производства фтор-18-содержащих
радиофармацевтических лекарственных препаратов для ПЭТ на модуле Synthra RN+ в программном обеспечении SynthraView («Synthra», Германия).
2. Разработана простая технология радиосинтеза сложных эфиров ш- [18Р]-фторалифатических карбоновых кислот с использованием исходных субстратов эфиров ш-иод-замещенных алифатических карбоновых кислот.
3. Предложен простой и эффективный способ автоматического радиосинтеза [18Р]-фторбензойной кислоты как простетической группы с использованием соединений поливалентного иода для радиофторирования.
По результатам работы сформулированы положения, выносимые на защиту:
1. Технология радиосинтеза сложных эфиров [18Р]-
фторалифатических карбоновых кислот и сукцинимидного эфира (NHS) 6-[18Р]- фторгексановой кислоты для производства фтор-18-содержащих таргетных РФЛП.
2. Технология автоматического синтеза 2-[18Р]-фтор-5-нитро- бензойную кислоты как простетической группы для радиофторирования при получении РФЛП.
Достоверность полученных данных
Анализ содержания продуктов фторирования проводился методом тонкослойной хроматографии на силикагеле (радио-ТСХ).
Апробация результатов работы
Результаты работы были представлены в виде устных и стендовых докладов на следующих конференциях:
1. Международная конференция “1st International Conference on Aptamers in Russia 2019” 27-30 августа, 2019, Красноярск.
2. III Международная научно-практическая конференция
"Актуальные проблемы разработки, производства и применения радиофармацевтических препаратов" РАДИОФАРМА-2019, 18-21 июня 2019, г. Москва.
3. Международная конференция 23 Интернациональный симпозиум по радиофармацевтическим наукам (23rd International Symposium on Radiopharmaceutical sciences), 26-31 мая, 2019 г, Китай, Пекин.
4. Международная летняя школа галогенорганической радиохимии
«CAFACHEM 2020», 26-28 августа 2020 г. Virtual Meeting, Лондон,
Великобритания.
5. 24-ый международный симпозиум по радиофармацевтическим наукам /International Symposium on Radiopharmaceutical sciences, «ISRS-2021» Society of Radiopharmaceutical Sciences ISRS-2021Virtual Meeting, May 17-19, 2021, Paris, France.
6. Конгресс молодых ученых «Актуальные вопросы фундаментальной и клинической медицины», 19-20 ноября 2020 г, г. Томск.
7. Международная конференция «Цифровые управляемые лекарства на стыке наук» 18-19 марта 2021 года, г. Красноярск.
8. Международная научно-практическая конференция «Разработка лекарственных средств - традиции и перспективы», 15-16 сентября, 2021 г., Томск.
9. Практическая конференция «РАДИОФАРМА-2021» «Актуальные проблемы разработки, производства и применения радиофармацевтических препаратов», 29 сентября-4 октября 2021 г., г. Переславль-Залесский.
Публикации.
По материалам диссертационной работы опубликовано 12 работ, в т.ч. 3 статьи в международных рецензируемых научных журналах, индексируемых в международных системах цитирования рекомендованных ВАК РФ для публикации диссертационных исследований, 9 тезисов и материалов докладов на международных и российских конференциях.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 4 глав, заключения, списка литературы из 128 наименований. Работа изложена на 129 страницах, содержит 67 рисунков, 17 таблиц.
Благодарности
Автор выражает искреннюю благодарность своему научному руководителю д.х.н. Юсубову М.С. (ИШХБМТ ТПУ); а также д.фарм.н. Ларькиной М.С. (ФГБОУ ВО СибГМУ Минздрава России) и к.х.н. Подрезовой Е.В. (ИШХБМТ ТПУ) за помощь в планировании экспериментов и советы в написании диссертационной работы.
Автор выражает огромную благодарность за помощь в организации экспериментов химику-эксперту Белугину К.В. (ФГБУ ФСНКЦ ФМБА России); провизору-аналитику Липайкину С.Ю. (ФГБУ ФСНКЦ ФМБА России); химику-эксперту Бадмаеву О.Н. (ФГБУ ФСНКЦ ФМБА России); начальнику ЦРХК Токареву Н.А. (ФГБУ ФСНКЦ ФМБА России), а также за предоставленную возможность проведения научного исследования на базе центра ядерной медицины ФГБУ ФСНКЦ ФМБА России директору центра ядерной медицины Чанчикову Н.Г. (ФГБУ ФСНКЦ ФМБА России) и генеральному директору ФГБУ ФСНКЦ ФМБА России Баранкину Б.В.
1) Разработана технология радиофторирования эфиров ш- иодалифатических карбоновых кислот, с целью получения 18-фторсодержащих простетических групп.
2) Для радиофторирования ш-иодпроизводных алифатических карбоновых кислот разработаны алгоритмические скрипты для радиосинтеза 6- [18Б]фторгексановой кислоты и сукцимимид-1-ил-6-[18Р]-фторгексаноата, как простетических групп для получения РФЛП.
3) Разработана технология радиофторирования эфиров арилиодоксолов, с целью получения 18-фторсодержащих ароматических карбоновых кислот, простетических групп.
4) Для радиофторирования арилбензоиодоксолов разработаны алгоритмические скрипты автоматического радиосинтеза 2-[18Р]-фтор-5- нитробензойной кислоты, как простетических групп для получения РФЛП.
2) Для радиофторирования ш-иодпроизводных алифатических карбоновых кислот разработаны алгоритмические скрипты для радиосинтеза 6- [18Б]фторгексановой кислоты и сукцимимид-1-ил-6-[18Р]-фторгексаноата, как простетических групп для получения РФЛП.
3) Разработана технология радиофторирования эфиров арилиодоксолов, с целью получения 18-фторсодержащих ароматических карбоновых кислот, простетических групп.
4) Для радиофторирования арилбензоиодоксолов разработаны алгоритмические скрипты автоматического радиосинтеза 2-[18Р]-фтор-5- нитробензойной кислоты, как простетических групп для получения РФЛП.
