Помощь студентам в учебе
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОБЩЕГО СОДЕРЖАНИЯ БАКТЕРИЙ В ПРИРОДНЫХ ВОДАХ МЕТОДОМ ФЛУОРИМЕТРИИ
|
Список сокращений 5
Введение 6
Глава 1. Литературный обзор 15
1.1. Основные показатели качества воды 15
1.2. Бактериологические показатели качества воды 17
1.3. Характеристика бактерий группы кишечной палочки 20
1.4. Характеристика синегнойной палочки 21
1.5. Определение бактериальной загрязненности природных вод 23
1.5.1. Определение колиформных бактерий 23
1.5.2. Определение общего содержания бактерий 27
1.6. Люминесценция 33
1.6.1. Применение люминесцентного анализа 36
1.7. Ферменты и коферменты метаболизма 38
1.7.1. Коферменты переноса водорода 38
1.7.2. Строение и свойства никотинамидадениндинуклеотида 39
1.8. Метаболизм бактерий 41
1.9. Характеристика лактобактерий 43
Глава 2. Аппаратура и методика эксперимента 47
2.1. Оборудование, объекты исследования и реактивы 47
2.1.1. Оборудование 47
2.1.2. Объекты исследования 50
2.1.3. Реактивы 51
2.2. Методика эксперимента 51
2.2.1. Исследование флуоресцентных свойств растворителя и стандартного
раствора NADH 51
2.2.2. Исследование флуоресцентных свойств медицинских препаратов 52
2.2.3. Определение количества бактерий методом прямого счета клеток в камере Горяева - Тома 52
Глава 3. Исследование оптических свойств бактерий методом флуориметрии 54
3.1. Изучение флуоресцентных свойств стандартного раствора NADH 54
3.2. Изучение природы сигнала внутриклеточного NADH методом
флуориметрии на примере лактобактерий 55
3.3. Влияние различных факторов на сигнал внутриклеточного NADH 59
3.3.1. Влияние водородного показателя 59
3.3.2. Влияние температуры 60
3.3.3. Влияние бактерицидных растворов 63
3.3.4. Влияние антибиотиков 65
Глава 4. Разработка методики определения общего содержания бактерий в природных водах 70
4.1. Пробоподготовка и выбор условий анализа 70
4.2. Исследование мешающего влияния различных компонентов на
флуоресцентный сигнал внутриклеточного NADH 73
4.2.1. Влияние фенола на флуоресцентный сигнал NADH 73
4.2.2. Влияние железа (III) на флуоресцентный сигнал NADH 75
4.2.3. Влияние гидрокарбонат-ионов на флуоресцентный сигнал NADH 76
4.2.4. Влияние гуминовых кислот на флуоресцентный сигнал NADH 78
4.3. Метрологические аспекты методики определения общего числа бактерий
в природных водах 79
4.3.1. Флуориметрический метод определения общего числа бактерий 82
4.3.2. Оценка показателя правильности методики анализа методом добавок 83
4.4. Построение градуировочного графика 84
4.4 Метод прямого счета клеток и флуориметрический метод определения общего содержания бактерий. Сравнительные испытания 86
4.4.1. Определение общего содержания бактерий в природных водах методом
флуориметрии 86
4.4.2. Определение общего содержания бактерий в воде метод прямого счета
клеток в камере Горяева 89
4.4.2.1. Исследование флуоресцентных свойств фуксина 89
4.4.2.2. Подсчет клеток в камере Горяева 92
Обсуждение результатов 95
Выводы 99
Список литературы 100
Приложение 1 111
Приложение 2 123
Приложение 3 128
Введение 6
Глава 1. Литературный обзор 15
1.1. Основные показатели качества воды 15
1.2. Бактериологические показатели качества воды 17
1.3. Характеристика бактерий группы кишечной палочки 20
1.4. Характеристика синегнойной палочки 21
1.5. Определение бактериальной загрязненности природных вод 23
1.5.1. Определение колиформных бактерий 23
1.5.2. Определение общего содержания бактерий 27
1.6. Люминесценция 33
1.6.1. Применение люминесцентного анализа 36
1.7. Ферменты и коферменты метаболизма 38
1.7.1. Коферменты переноса водорода 38
1.7.2. Строение и свойства никотинамидадениндинуклеотида 39
1.8. Метаболизм бактерий 41
1.9. Характеристика лактобактерий 43
Глава 2. Аппаратура и методика эксперимента 47
2.1. Оборудование, объекты исследования и реактивы 47
2.1.1. Оборудование 47
2.1.2. Объекты исследования 50
2.1.3. Реактивы 51
2.2. Методика эксперимента 51
2.2.1. Исследование флуоресцентных свойств растворителя и стандартного
раствора NADH 51
2.2.2. Исследование флуоресцентных свойств медицинских препаратов 52
2.2.3. Определение количества бактерий методом прямого счета клеток в камере Горяева - Тома 52
Глава 3. Исследование оптических свойств бактерий методом флуориметрии 54
3.1. Изучение флуоресцентных свойств стандартного раствора NADH 54
3.2. Изучение природы сигнала внутриклеточного NADH методом
флуориметрии на примере лактобактерий 55
3.3. Влияние различных факторов на сигнал внутриклеточного NADH 59
3.3.1. Влияние водородного показателя 59
3.3.2. Влияние температуры 60
3.3.3. Влияние бактерицидных растворов 63
3.3.4. Влияние антибиотиков 65
Глава 4. Разработка методики определения общего содержания бактерий в природных водах 70
4.1. Пробоподготовка и выбор условий анализа 70
4.2. Исследование мешающего влияния различных компонентов на
флуоресцентный сигнал внутриклеточного NADH 73
4.2.1. Влияние фенола на флуоресцентный сигнал NADH 73
4.2.2. Влияние железа (III) на флуоресцентный сигнал NADH 75
4.2.3. Влияние гидрокарбонат-ионов на флуоресцентный сигнал NADH 76
4.2.4. Влияние гуминовых кислот на флуоресцентный сигнал NADH 78
4.3. Метрологические аспекты методики определения общего числа бактерий
в природных водах 79
4.3.1. Флуориметрический метод определения общего числа бактерий 82
4.3.2. Оценка показателя правильности методики анализа методом добавок 83
4.4. Построение градуировочного графика 84
4.4 Метод прямого счета клеток и флуориметрический метод определения общего содержания бактерий. Сравнительные испытания 86
4.4.1. Определение общего содержания бактерий в природных водах методом
флуориметрии 86
4.4.2. Определение общего содержания бактерий в воде метод прямого счета
клеток в камере Горяева 89
4.4.2.1. Исследование флуоресцентных свойств фуксина 89
4.4.2.2. Подсчет клеток в камере Горяева 92
Обсуждение результатов 95
Выводы 99
Список литературы 100
Приложение 1 111
Приложение 2 123
Приложение 3 128
Актуальность
На сегодняшний день, по данным Всемирной Организации Здравоохранения, почти три миллиарда жителей нашей планеты употребляют некачественную воду. По статистике от употребления грязной воды, в мире ежегодно умирает 18 миллионов взрослых и 4 миллиона детей. Особенно важна проблема бактериальной загрязненности природных вод. Создание чувствительных, экспрессных, точных и простых методов определения общего содержания бактерий в природных водах является актуальной задачей химиков - аналитиков всего мира.
Традиционными методами определения содержания патогенных микроорганизмов являются чашечный метод Коха и метод прямого подсчета клеток под микроскопом (ГОСТ 18963-73 Вода питьевая. Методы санитарно-бактериологического анализа). Однако эти методы занимают много времени, трудоемки и обладают низкой чувствительностью.
В последнее время широко распространены инструментальные методы определения общего содержания бактерий в водах. Например, метод нефелометрии. В его основе лежит измерение ослабления светового пучка при его прохождении через клеточную суспензию. Данный метод обладает рядом недостатков: концентрация клеток должна быть не высокой, иначе будет происходить вторичное рассеяние света клетками, что искажает результат определения; питательная среда для культивирования микроорганизмов должна быть оптически прозрачной; метод пригоден лишь для тех микроорганизмов, рост которых сопровождается равномерным помутнением среды. Другим примером может быть определение количества клеток с использованием метода проточной цитометрии. В основе метода лежит принцип регистрации светового или электрического сигнала при прохождении частицы по капилляру. Недостатками данного метода является высокая цена оборудования и необходимость использования дорогостоящих флуоресцентных красителей для уменьшения мешающего влияния содержащихся в пробе частиц различных примесей.
Метод флуориметрии обладает неоспоримыми преимуществами по сравнению с традиционными методами:
1. Сверхвысокая чувствительность (использование современной
инструментальной базы позволяет идентифицировать и анализировать отдельные молекулы)
2. Мультиплексность детекции (возможность наблюдения за
несколькими объектами одновременно при условии несовпадения между собой спектров эмиссии этих объектов)
3. Совместимость с живыми организмами (свет видимого спектра не поглощается водой, биологическими макромолекулами и другими компонентами живых клеток и не влияет на процессы, происходящие в клетке)
4.Экспрессность (процесс флуоресценции происходит за наносекунды, что позволяет сократить время анализа)
Все эти преимущества позволяют использовать метод флуориметрии для определения бактериологических показателей качества воды, в частности, общего содержания бактерий.
Цель диссертационной работы
Исследовать флуоресцентные свойства никотинамидадениндинуклеотида (NADH) как внутриклеточного метаболита бактерий, с целью разработки флуориметрической методики определения общей бактериальной загрязненности природных вод.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
1. Исследовать флуоресцентные свойства внутриклеточного метаболита NADH, как маркера общего содержания бактерий в воде.
2. Исследовать влияние различных факторов на аналитический сигнал NADH (длина волны возбуждения флуоресценции, параметры измерения сигнала, водородный показатель, влияние бактерицидных веществ).
3. Разработать методику определения общего содержания бактерий в природных водах методом флуориметрии.
4. Оценить мешающее влияние компонентов, содержащихся в природной воде на флуоресцентный сигнал внутриклеточного NADH.
5. Провести сравнительные испытания определения содержания бактерий в природных водах флуориметрическим методом и методом подсчета клеток в камере Г оряева.
Научная новизна
1. Выявлены закономерности получения прямого сигнала
внутриклеточного NADH методом флуориметрии. Изучена природа сигнала на примере лактобактерий. Показано, что сигнал имеет флуоресцентную природу с параметрами: длина волны возбуждения флуоресценции 360 нм, максимум регистрации флуоресценции 440 - 460 нм, время задержки
измерительного строба 1 мкс, время длительности измерительного строба 40 мкс. Показана возможность получения стабильного и воспроизводимого флуоресцентного сигнала NADH без предварительной его экстракции из бактериальной клетки.
2. Впервые изучены закономерности влияния рН на аналитический сигнал внутриклеточного NADH на примере штамма М17 бактерий E-coli. Показано, что оптимальным значением рН среды является 6.86, что соответствует нейтральной среде.
3. Изучено влияние ряда антибиотиков широкого спектра действия на сигнал внутриклеточного NADH на примере лактобактерий. Показано, что амоксициллин не вызывает гибель бактерий, а цефазолин и тетрациклин оказывает губительное воздействие на молочнокислые бактерии.
4. Изучено влияние ряда бактерицидных веществ на штамм М 17 E coli методом флуориметрии. Показано, что 6 % раствор пероксида водорода и 70 % раствор этилового спирта оказывают бактерицидное воздействие на бактерии группы кишечной палочки, снижая интенсивность флуоресценции внутриклеточного NADH.
5. Изучено мешающее влияние ряда веществ (фенол, гуминовые кислоты, железо (III), гидрокарбонат натрия) на аналитический сигнал внутриклеточного NADH. Показано, что растворы фенола, железа (III) и гидрокарбоната натрия в концентрациях, соответствующих ПДК, не оказывают мешающего влияния на регистрацию флуоресценции NADH. Установлено, что присутствие гуминовых кислот оказывает мешающее влияние на флуориметрическое определение внутриклеточного NADH, однако данное влияние устраняется на стадии пробоподготовки путем доведения анализируемого образца до рН = 4 с последующим отстаиванием гуминовых кислот.
Практическая значимость
1. Подобраны оптимальные условия флуориметрического определения бактериальной загрязненности природных вод.
2. Разработана методика определения содержания бактерий в природных водах методом флуориметрии, обладающим высокой чувствительностью, воспроизводимостью, простотой использования и экспрессностью.
3. Проведено сравнительное определение содержания бактерий в воде рек г. Томска.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Результаты оценки влияния различных факторов на флуоресцентный сигнал внутриклеточного NADH (длина волны возбуждения флуоресценции,
10 параметры измерения сигнала, водородный показатель, бактерицидные вещества).
2. Результаты оценки влияния ряда веществ, содержащихся в природной воде (фенол, гуминовые кислоты, гидрокарбонат-ионы, железо (III)) на аналитический сигнал внутриклеточного NADH.
3. Флуориметрическая методика определения общего содержания бактерий в природных водах на основании измерения интенсивности флуоресценции бактериального NADH.
4. Результаты сравнительных испытаний определения общего содержания бактерий в природных водах флуориметрическим методом и методом прямого подсчета клеток в камере Горяева.
Апробация работы
Результаты диссертационной работы докладывались и обсуждались на:
1. Первой Зимней молодежной школе-конференции с международным участием «Новые методы аналитической химии» (Санкт-Петербург, 2013).
2. XVII Международном симпозиуме имени академика М. А. Усова студентов и молодых ученых «Проблемы геологии и освоения недр» (Томск, 2013).
3. XVII международной конференции EuroFoodChem (Стамбул, Турция, 2013).
4. XIV Всероссийской научно-практической конференции имени профессора Л.П. Кулёва студентов и молодых ученых с международным участием (Томск, 2013).
5. XV Международной научно-практической конференции студентов и молодых ученых имени профессора Л.П. Кулёва (Томск, 2014).
6. VII Всероссийской научной студенческой конференции с элементами научной школы имени профессора М.К.Коровина «Творчество юных - шаг в успешное будущее) (Томск, 2014).
7. Всероссийском конкурсе научно-технического творчества молодежи «НТТМ-2015» в рамках Московского международного салона образования ММСО-2015. (Москва, 2015).
8. XVI Международной научно-практической конференции студентов и молодых ученых имени профессора Л.П. Кулёва (Томск, 2015).
9. Научно-технических семинарах кафедры физической и аналитической химии Томского политехнического университета.
Публикации
Результаты выполненных исследований отражены в 11 печатных работах, в т.ч. в 8 тезисах докладов на всероссийских и международных конференциях, 3 статьях в научных журналах, из них 2 статьи в научных журналах, индексируемых базами ЗСОРИЗ и Web of Science, 1 статья в рецензируемых научных изданиях, рекомендованных ВАК.
Работа выполнена при финансовой поддержке грантов:
1. Программа ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2007-2013 годы, № 14.B37.21.0811, мероприятие
1.2.1, тема: «Создание теоретических основ, высокочувствительных методик и сенсоров для электрохимических методов анализа биологически активных веществ»
Научный руководитель, д.х.н., профессор каф. ФАХ ИПР Короткова Е.И.
2. Программа ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2007-2013 годы, № 14.740.11.1369, мероприятие
1.1, тема: «Разработка высокочувствительных методик определения и исследование биологически активных веществ с антиоксидантными свойствами в объектах природного и искусственного происхождения с целью совершенствования профилактики и лечения социально-значимых заболеваний»
Научный руководитель, к.х.н., ассистент каф. ФАХ ИНР Воронова О.А.
3. Программа ФЦН «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2007-2013 годы, 14.B37.21.1183, мероприятие 1.3.1, тема: «Сравнительные исследования антиоксидантной активности природных объектов физико-химическими методами анализа»
Научный руководитель, к.х.н., Дорожко Е.В.
4. Нроект ТНУ ВИУ_ИНР_2014 «Разработка биосенсора и тест-системы на холестерин для контроля качества пищевых продуктов», руководитель проекта д.х.н., профессор каф. ФАХ ИНР Короткова Е.И
5. Гос. задание «Наука» № 1.1310.2014 (№ госрегистрации 01201459775) «Разработка научных основ получения функциональных полимерных материалов с контролируемым комплексом свойств на основе глубокой переработке углеводородного сырья», руководитель проекта д.х.н., профессор каф. ФАХ ИНР Короткова Е.И.
6. Гос. задание «Наука» № 4.1619.2014/к от 11.06.2014 «Разработка тест- системы определения гепаринов для коагулологического контроля при сердечно-сосудистых заболеваниях», руководитель проекта д.х.н., профессор каф. ФАХ ИНР Короткова Е.И.
Объем и структура диссертации
Диссертация состоит из введения, 4-ех глав, выводов, списка литературы (102 ссылки) и приложений. Работа изложена на 129 страницах машинописного текста, включая 37 рисунков и 8 таблиц.
Основное содержание работы
Во введении обоснована актуальность выбранной темы, сформулирована цель исследований, показана научная новизна и практическая значимость работы.
В первой главе описаны основные показатели качества природных вод, в частности подробно рассмотрены бактериологические показатели. Представлен обзор методов определения бактериологических показателей качества природных вод, как прямых, так и косвенных. Приведена характеристика бактерий Escherichia coli(кишечная палочка) и Pseudomonas aeruginosa(синегнойная палочка), являющиеся основными представителями бактериальной микрофлоры всех водоемов. Описан процесс метаболизма данных микроорганизмов. Дано краткое описание явления люминесценции и показана возможность использования люминесцентного анализа для исследования различных природных и биологических объектов, в частности, для определения количественного содержания бактерий в исследуемых объектах.
Вторая глава посвящена описанию используемой аппаратуры и методик измерений. Охарактеризованы объекты исследования и описаны методики проведения экспериментов. Исследования проводились на спектрофлуориметре «Флюорат 02-Панорама» (ООО «Люмэкс» г. Санкт - Петербург).
В третьей главе описана природа аналитического сигнала, установлено различие в оптических свойствах стандартного раствора NADH и NADH внутриклеточного. Подобраны оптимальные условия получения аналитического сигнала NADH внутриклеточного, как маркера жизненной активности бактерий. Показано влияние различных параметров на аналитический сигнал.
Четвертая глава посвящена разработке методики определения общего содержания бактерий в природных водах. Описан процесс пробоподготовки анализируемого объекта. Показано влияние ряда веществ, содержащихся в природных водах на аналитический сигнал внутриклеточного NADH. Установлено, что присутствие в воде фенола, гидрокарбонат-ионов и ионов Fe 3+ в концентрациях, равных ПДК, не влияют на регистрацию аналитического сигнала, а присутствие гуминовых кислот затрудняет регистрацию флуоресценции внутриклеточного NADH, однако данное мешающее влияние устраняется на стадии пробоподготовки. Определены основные метрологические характеристики разработанной методики. Проведено определение количественного содержания бактерий в природных водах методом флуориметрии и методом подсчета клеток в камере Горяева.
На сегодняшний день, по данным Всемирной Организации Здравоохранения, почти три миллиарда жителей нашей планеты употребляют некачественную воду. По статистике от употребления грязной воды, в мире ежегодно умирает 18 миллионов взрослых и 4 миллиона детей. Особенно важна проблема бактериальной загрязненности природных вод. Создание чувствительных, экспрессных, точных и простых методов определения общего содержания бактерий в природных водах является актуальной задачей химиков - аналитиков всего мира.
Традиционными методами определения содержания патогенных микроорганизмов являются чашечный метод Коха и метод прямого подсчета клеток под микроскопом (ГОСТ 18963-73 Вода питьевая. Методы санитарно-бактериологического анализа). Однако эти методы занимают много времени, трудоемки и обладают низкой чувствительностью.
В последнее время широко распространены инструментальные методы определения общего содержания бактерий в водах. Например, метод нефелометрии. В его основе лежит измерение ослабления светового пучка при его прохождении через клеточную суспензию. Данный метод обладает рядом недостатков: концентрация клеток должна быть не высокой, иначе будет происходить вторичное рассеяние света клетками, что искажает результат определения; питательная среда для культивирования микроорганизмов должна быть оптически прозрачной; метод пригоден лишь для тех микроорганизмов, рост которых сопровождается равномерным помутнением среды. Другим примером может быть определение количества клеток с использованием метода проточной цитометрии. В основе метода лежит принцип регистрации светового или электрического сигнала при прохождении частицы по капилляру. Недостатками данного метода является высокая цена оборудования и необходимость использования дорогостоящих флуоресцентных красителей для уменьшения мешающего влияния содержащихся в пробе частиц различных примесей.
Метод флуориметрии обладает неоспоримыми преимуществами по сравнению с традиционными методами:
1. Сверхвысокая чувствительность (использование современной
инструментальной базы позволяет идентифицировать и анализировать отдельные молекулы)
2. Мультиплексность детекции (возможность наблюдения за
несколькими объектами одновременно при условии несовпадения между собой спектров эмиссии этих объектов)
3. Совместимость с живыми организмами (свет видимого спектра не поглощается водой, биологическими макромолекулами и другими компонентами живых клеток и не влияет на процессы, происходящие в клетке)
4.Экспрессность (процесс флуоресценции происходит за наносекунды, что позволяет сократить время анализа)
Все эти преимущества позволяют использовать метод флуориметрии для определения бактериологических показателей качества воды, в частности, общего содержания бактерий.
Цель диссертационной работы
Исследовать флуоресцентные свойства никотинамидадениндинуклеотида (NADH) как внутриклеточного метаболита бактерий, с целью разработки флуориметрической методики определения общей бактериальной загрязненности природных вод.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
1. Исследовать флуоресцентные свойства внутриклеточного метаболита NADH, как маркера общего содержания бактерий в воде.
2. Исследовать влияние различных факторов на аналитический сигнал NADH (длина волны возбуждения флуоресценции, параметры измерения сигнала, водородный показатель, влияние бактерицидных веществ).
3. Разработать методику определения общего содержания бактерий в природных водах методом флуориметрии.
4. Оценить мешающее влияние компонентов, содержащихся в природной воде на флуоресцентный сигнал внутриклеточного NADH.
5. Провести сравнительные испытания определения содержания бактерий в природных водах флуориметрическим методом и методом подсчета клеток в камере Г оряева.
Научная новизна
1. Выявлены закономерности получения прямого сигнала
внутриклеточного NADH методом флуориметрии. Изучена природа сигнала на примере лактобактерий. Показано, что сигнал имеет флуоресцентную природу с параметрами: длина волны возбуждения флуоресценции 360 нм, максимум регистрации флуоресценции 440 - 460 нм, время задержки
измерительного строба 1 мкс, время длительности измерительного строба 40 мкс. Показана возможность получения стабильного и воспроизводимого флуоресцентного сигнала NADH без предварительной его экстракции из бактериальной клетки.
2. Впервые изучены закономерности влияния рН на аналитический сигнал внутриклеточного NADH на примере штамма М17 бактерий E-coli. Показано, что оптимальным значением рН среды является 6.86, что соответствует нейтральной среде.
3. Изучено влияние ряда антибиотиков широкого спектра действия на сигнал внутриклеточного NADH на примере лактобактерий. Показано, что амоксициллин не вызывает гибель бактерий, а цефазолин и тетрациклин оказывает губительное воздействие на молочнокислые бактерии.
4. Изучено влияние ряда бактерицидных веществ на штамм М 17 E coli методом флуориметрии. Показано, что 6 % раствор пероксида водорода и 70 % раствор этилового спирта оказывают бактерицидное воздействие на бактерии группы кишечной палочки, снижая интенсивность флуоресценции внутриклеточного NADH.
5. Изучено мешающее влияние ряда веществ (фенол, гуминовые кислоты, железо (III), гидрокарбонат натрия) на аналитический сигнал внутриклеточного NADH. Показано, что растворы фенола, железа (III) и гидрокарбоната натрия в концентрациях, соответствующих ПДК, не оказывают мешающего влияния на регистрацию флуоресценции NADH. Установлено, что присутствие гуминовых кислот оказывает мешающее влияние на флуориметрическое определение внутриклеточного NADH, однако данное влияние устраняется на стадии пробоподготовки путем доведения анализируемого образца до рН = 4 с последующим отстаиванием гуминовых кислот.
Практическая значимость
1. Подобраны оптимальные условия флуориметрического определения бактериальной загрязненности природных вод.
2. Разработана методика определения содержания бактерий в природных водах методом флуориметрии, обладающим высокой чувствительностью, воспроизводимостью, простотой использования и экспрессностью.
3. Проведено сравнительное определение содержания бактерий в воде рек г. Томска.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Результаты оценки влияния различных факторов на флуоресцентный сигнал внутриклеточного NADH (длина волны возбуждения флуоресценции,
10 параметры измерения сигнала, водородный показатель, бактерицидные вещества).
2. Результаты оценки влияния ряда веществ, содержащихся в природной воде (фенол, гуминовые кислоты, гидрокарбонат-ионы, железо (III)) на аналитический сигнал внутриклеточного NADH.
3. Флуориметрическая методика определения общего содержания бактерий в природных водах на основании измерения интенсивности флуоресценции бактериального NADH.
4. Результаты сравнительных испытаний определения общего содержания бактерий в природных водах флуориметрическим методом и методом прямого подсчета клеток в камере Горяева.
Апробация работы
Результаты диссертационной работы докладывались и обсуждались на:
1. Первой Зимней молодежной школе-конференции с международным участием «Новые методы аналитической химии» (Санкт-Петербург, 2013).
2. XVII Международном симпозиуме имени академика М. А. Усова студентов и молодых ученых «Проблемы геологии и освоения недр» (Томск, 2013).
3. XVII международной конференции EuroFoodChem (Стамбул, Турция, 2013).
4. XIV Всероссийской научно-практической конференции имени профессора Л.П. Кулёва студентов и молодых ученых с международным участием (Томск, 2013).
5. XV Международной научно-практической конференции студентов и молодых ученых имени профессора Л.П. Кулёва (Томск, 2014).
6. VII Всероссийской научной студенческой конференции с элементами научной школы имени профессора М.К.Коровина «Творчество юных - шаг в успешное будущее) (Томск, 2014).
7. Всероссийском конкурсе научно-технического творчества молодежи «НТТМ-2015» в рамках Московского международного салона образования ММСО-2015. (Москва, 2015).
8. XVI Международной научно-практической конференции студентов и молодых ученых имени профессора Л.П. Кулёва (Томск, 2015).
9. Научно-технических семинарах кафедры физической и аналитической химии Томского политехнического университета.
Публикации
Результаты выполненных исследований отражены в 11 печатных работах, в т.ч. в 8 тезисах докладов на всероссийских и международных конференциях, 3 статьях в научных журналах, из них 2 статьи в научных журналах, индексируемых базами ЗСОРИЗ и Web of Science, 1 статья в рецензируемых научных изданиях, рекомендованных ВАК.
Работа выполнена при финансовой поддержке грантов:
1. Программа ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2007-2013 годы, № 14.B37.21.0811, мероприятие
1.2.1, тема: «Создание теоретических основ, высокочувствительных методик и сенсоров для электрохимических методов анализа биологически активных веществ»
Научный руководитель, д.х.н., профессор каф. ФАХ ИПР Короткова Е.И.
2. Программа ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2007-2013 годы, № 14.740.11.1369, мероприятие
1.1, тема: «Разработка высокочувствительных методик определения и исследование биологически активных веществ с антиоксидантными свойствами в объектах природного и искусственного происхождения с целью совершенствования профилактики и лечения социально-значимых заболеваний»
Научный руководитель, к.х.н., ассистент каф. ФАХ ИНР Воронова О.А.
3. Программа ФЦН «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2007-2013 годы, 14.B37.21.1183, мероприятие 1.3.1, тема: «Сравнительные исследования антиоксидантной активности природных объектов физико-химическими методами анализа»
Научный руководитель, к.х.н., Дорожко Е.В.
4. Нроект ТНУ ВИУ_ИНР_2014 «Разработка биосенсора и тест-системы на холестерин для контроля качества пищевых продуктов», руководитель проекта д.х.н., профессор каф. ФАХ ИНР Короткова Е.И
5. Гос. задание «Наука» № 1.1310.2014 (№ госрегистрации 01201459775) «Разработка научных основ получения функциональных полимерных материалов с контролируемым комплексом свойств на основе глубокой переработке углеводородного сырья», руководитель проекта д.х.н., профессор каф. ФАХ ИНР Короткова Е.И.
6. Гос. задание «Наука» № 4.1619.2014/к от 11.06.2014 «Разработка тест- системы определения гепаринов для коагулологического контроля при сердечно-сосудистых заболеваниях», руководитель проекта д.х.н., профессор каф. ФАХ ИНР Короткова Е.И.
Объем и структура диссертации
Диссертация состоит из введения, 4-ех глав, выводов, списка литературы (102 ссылки) и приложений. Работа изложена на 129 страницах машинописного текста, включая 37 рисунков и 8 таблиц.
Основное содержание работы
Во введении обоснована актуальность выбранной темы, сформулирована цель исследований, показана научная новизна и практическая значимость работы.
В первой главе описаны основные показатели качества природных вод, в частности подробно рассмотрены бактериологические показатели. Представлен обзор методов определения бактериологических показателей качества природных вод, как прямых, так и косвенных. Приведена характеристика бактерий Escherichia coli(кишечная палочка) и Pseudomonas aeruginosa(синегнойная палочка), являющиеся основными представителями бактериальной микрофлоры всех водоемов. Описан процесс метаболизма данных микроорганизмов. Дано краткое описание явления люминесценции и показана возможность использования люминесцентного анализа для исследования различных природных и биологических объектов, в частности, для определения количественного содержания бактерий в исследуемых объектах.
Вторая глава посвящена описанию используемой аппаратуры и методик измерений. Охарактеризованы объекты исследования и описаны методики проведения экспериментов. Исследования проводились на спектрофлуориметре «Флюорат 02-Панорама» (ООО «Люмэкс» г. Санкт - Петербург).
В третьей главе описана природа аналитического сигнала, установлено различие в оптических свойствах стандартного раствора NADH и NADH внутриклеточного. Подобраны оптимальные условия получения аналитического сигнала NADH внутриклеточного, как маркера жизненной активности бактерий. Показано влияние различных параметров на аналитический сигнал.
Четвертая глава посвящена разработке методики определения общего содержания бактерий в природных водах. Описан процесс пробоподготовки анализируемого объекта. Показано влияние ряда веществ, содержащихся в природных водах на аналитический сигнал внутриклеточного NADH. Установлено, что присутствие в воде фенола, гидрокарбонат-ионов и ионов Fe 3+ в концентрациях, равных ПДК, не влияют на регистрацию аналитического сигнала, а присутствие гуминовых кислот затрудняет регистрацию флуоресценции внутриклеточного NADH, однако данное мешающее влияние устраняется на стадии пробоподготовки. Определены основные метрологические характеристики разработанной методики. Проведено определение количественного содержания бактерий в природных водах методом флуориметрии и методом подсчета клеток в камере Горяева.
1. Исследованы флуоресцентные свойства внутриклеточного метаболита NADH и его стандартного раствора, определены длины волн возбуждения и регистрации флуоресценции для получения его аналитического сигнала. Показано, что при одной длине волны возбуждения 360 нм положение максимумом флуоресценции стандартного раствора NADH и NADH внутриклеточного отличаются на 20 нм, что согласуется с литературными данными. Показана возможность регистрации спектра флуоресценции внутриклеточного NADH без предварительного экстрагирования его из клетки. Определена природа регистрируемого сигнала.
2. Исследовано влияние различных факторов (длина волны возбуждения флуоресценции, параметры измерения сигнала, рН, температура, добавление бактерицидных веществ) на бактерии различных групп по изменению интенсивности флуоресценции внутриклеточного NADH. Показано, что регистрация флуоресценции внутриклеточного NADH возможна только в живых клетках.
3. Разработана методика количественного определения бактерий в природных водах методом флуориметрии в диапазоне содержаний от 1*106 до 8*106 КОЕ. Проведена оценка метрологических характеристик методики.
4. Показано мешающее влияние содержащихся в природной воде компонентов (фенол, гидрокарбонат-ионы, железо (III), гуминовые кислоты) на регистрацию флуоресцентного сигнала NADH. Установлено, что присутствие гуминовых кислот оказывает мешающее влияние на флуориметрическое определение внутриклеточного NADH, однако данное влияние устраняется на стадии пробоподготовки.
5. Проведено сравнительное определение содержания бактерий в природных водах методом подсчета клеток в камере Горяева.
2. Исследовано влияние различных факторов (длина волны возбуждения флуоресценции, параметры измерения сигнала, рН, температура, добавление бактерицидных веществ) на бактерии различных групп по изменению интенсивности флуоресценции внутриклеточного NADH. Показано, что регистрация флуоресценции внутриклеточного NADH возможна только в живых клетках.
3. Разработана методика количественного определения бактерий в природных водах методом флуориметрии в диапазоне содержаний от 1*106 до 8*106 КОЕ. Проведена оценка метрологических характеристик методики.
4. Показано мешающее влияние содержащихся в природной воде компонентов (фенол, гидрокарбонат-ионы, железо (III), гуминовые кислоты) на регистрацию флуоресцентного сигнала NADH. Установлено, что присутствие гуминовых кислот оказывает мешающее влияние на флуориметрическое определение внутриклеточного NADH, однако данное влияние устраняется на стадии пробоподготовки.
5. Проведено сравнительное определение содержания бактерий в природных водах методом подсчета клеток в камере Горяева.