Помощь студентам в учебе
ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ НИТРИТ-ИОНОВ И S- НИТРОЗОТИОЛОВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ
|
ВВЕДЕНИЕ 5
ГЛАВА 1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 11
1.1 Оксид азота. История открытия и биологическая роль 11
1.2 Физические и химические свойства оксида азота 13
1.3 Биологический синтез оксида азота в организме человека 14
1.4 Методы определения оксида азота и его метаболитов 15
1.4.1 Спектроскопические методики 16
1.4.2 Электрохимические сенсоры для определения оксида азота и продуктов
его окисления 22
1.4.2.1 Прямое определение оксида азота на различных электродах 24
1.4.2.2 Косвенное определение оксида азота через нитрит-ионы 33
1.5 S-нитрозотиолы. Значение S-нитрозотиолов в биологических системах . 36
1.6 Методы определения нитрозотиолов в биологических системах 37
ГЛАВА 2 АППАРАТУРА И МЕТОДИКА ЭКСПЕРИМЕНТА 40
2.1 Оборудование, электроды, химическая посуда 40
2.2 Реактивы 42
2.3 Растворы и модификатор 43
2.4 Подготовка модифицированного электрода 46
2.5 Объекты исследования 46
2.6 Методика приготовления надклеточных жидкостей макрофагов 47
2.7 Методика подготовки образцов крови для вольтамперометрического
определения нитрозотиолов 48
2.8 Методика эксперимента 48
2.9 Методика проведения микроскопических исследований поверхности
электродов 50
2.10 Статистическая обработка данных 51
ГЛАВА 3 ИССЛЕДОВАНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ ЗАКОНОМЕРНОСТЕЙ ОКИСЛЕНИЯ НИТРИТ-ИОНОВ НА МОДИФИЦИРОВАННОМ ЭЛЕКТРОДЕ 52
3.1 Характеристика модифицированного электрода и исследование его
поверхности методом сканирующей микроскопии 52
3.2 Влияние различных факторов на сигнал электроокисления нитрит-ионов54
3.2.1 Влияние рН фонового электролита на сигнал электроокисления нитрит-
ионов 54
3.2.2 Влияние параметров электролиза (потенциала и времени накопления) на
сигнал электроокисления нитрит-ионов 55
3.3 Исследование механизма электроокисления нитрит-ионов на графитовом
модифицированном электроде 56
3.4 Исследование влияния адсорбционной составляющей на процесс
электроокисления нитрит-ионов на модифицированном электроде 57
ГЛАВА 4 ИССЛЕДОВАНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ ЗАКОНОМЕРНОСТЕЙ
ВОССТАНОВЛЕНИЯ SNAP 59
4.1 Оценка электрохимических свойств SNAP 59
4.2 Влияние рН фонового электролита на электровосстановление SNAP 60
4.3 Влияние параметров электролиза (потенциала и времени накопления) на
электровосстановление SNAP 62
4.4 Исследование механизма восстановления SNAP на модифицированном
электроде 63
4.5 Влияние адсорбционной составляющей на электровосстановление SNAP65 ГЛАВА 5 РАЗРАБОТКА ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИЧЕСКИХ МЕТОДИК ОПРЕДЕЛЕНИЯ НИТРИТ-ИОНОВ И НИТРОЗОТИОЛОВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ
ОБЪЕКТАХ 67
5.1 Вольтамперометрическое определение нитрит-ионов на ГМЭ 67
5.2 Оценка мешающего влияния компонентов биологической матрицы на вольтамперометрическое определение нитрит-ионов и пробоподготовка объектов 68
5.3 Определение нитрит-ионов методом спектрофотометрии 69
5.4 Оценка функционального статуса макрофагов, определение нитрит-ионов в
надклеточных жидкостях макрофагов 71
5.5 Вольтамперометрическое определение нитрозотиолов на ГМЭ 73
5.6 Определение S-нитрозотиолов методом флуориметрии 75
5.7 Определение нитрозотиолов в биологических жидкостях 75
5.8 Метрологические характеристики вольтамперометрической методики
определения нитрит-ионов на ГМЭ 77
5.9 Метрологические характеристики вольтамперометрической методики
определения SNAP 80
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 84
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ 86
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 88
Приложение А (оценка повторяемости и воспроизводимости методики анализа)
105
ГЛАВА 1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 11
1.1 Оксид азота. История открытия и биологическая роль 11
1.2 Физические и химические свойства оксида азота 13
1.3 Биологический синтез оксида азота в организме человека 14
1.4 Методы определения оксида азота и его метаболитов 15
1.4.1 Спектроскопические методики 16
1.4.2 Электрохимические сенсоры для определения оксида азота и продуктов
его окисления 22
1.4.2.1 Прямое определение оксида азота на различных электродах 24
1.4.2.2 Косвенное определение оксида азота через нитрит-ионы 33
1.5 S-нитрозотиолы. Значение S-нитрозотиолов в биологических системах . 36
1.6 Методы определения нитрозотиолов в биологических системах 37
ГЛАВА 2 АППАРАТУРА И МЕТОДИКА ЭКСПЕРИМЕНТА 40
2.1 Оборудование, электроды, химическая посуда 40
2.2 Реактивы 42
2.3 Растворы и модификатор 43
2.4 Подготовка модифицированного электрода 46
2.5 Объекты исследования 46
2.6 Методика приготовления надклеточных жидкостей макрофагов 47
2.7 Методика подготовки образцов крови для вольтамперометрического
определения нитрозотиолов 48
2.8 Методика эксперимента 48
2.9 Методика проведения микроскопических исследований поверхности
электродов 50
2.10 Статистическая обработка данных 51
ГЛАВА 3 ИССЛЕДОВАНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ ЗАКОНОМЕРНОСТЕЙ ОКИСЛЕНИЯ НИТРИТ-ИОНОВ НА МОДИФИЦИРОВАННОМ ЭЛЕКТРОДЕ 52
3.1 Характеристика модифицированного электрода и исследование его
поверхности методом сканирующей микроскопии 52
3.2 Влияние различных факторов на сигнал электроокисления нитрит-ионов54
3.2.1 Влияние рН фонового электролита на сигнал электроокисления нитрит-
ионов 54
3.2.2 Влияние параметров электролиза (потенциала и времени накопления) на
сигнал электроокисления нитрит-ионов 55
3.3 Исследование механизма электроокисления нитрит-ионов на графитовом
модифицированном электроде 56
3.4 Исследование влияния адсорбционной составляющей на процесс
электроокисления нитрит-ионов на модифицированном электроде 57
ГЛАВА 4 ИССЛЕДОВАНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ ЗАКОНОМЕРНОСТЕЙ
ВОССТАНОВЛЕНИЯ SNAP 59
4.1 Оценка электрохимических свойств SNAP 59
4.2 Влияние рН фонового электролита на электровосстановление SNAP 60
4.3 Влияние параметров электролиза (потенциала и времени накопления) на
электровосстановление SNAP 62
4.4 Исследование механизма восстановления SNAP на модифицированном
электроде 63
4.5 Влияние адсорбционной составляющей на электровосстановление SNAP65 ГЛАВА 5 РАЗРАБОТКА ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИЧЕСКИХ МЕТОДИК ОПРЕДЕЛЕНИЯ НИТРИТ-ИОНОВ И НИТРОЗОТИОЛОВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ
ОБЪЕКТАХ 67
5.1 Вольтамперометрическое определение нитрит-ионов на ГМЭ 67
5.2 Оценка мешающего влияния компонентов биологической матрицы на вольтамперометрическое определение нитрит-ионов и пробоподготовка объектов 68
5.3 Определение нитрит-ионов методом спектрофотометрии 69
5.4 Оценка функционального статуса макрофагов, определение нитрит-ионов в
надклеточных жидкостях макрофагов 71
5.5 Вольтамперометрическое определение нитрозотиолов на ГМЭ 73
5.6 Определение S-нитрозотиолов методом флуориметрии 75
5.7 Определение нитрозотиолов в биологических жидкостях 75
5.8 Метрологические характеристики вольтамперометрической методики
определения нитрит-ионов на ГМЭ 77
5.9 Метрологические характеристики вольтамперометрической методики
определения SNAP 80
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 84
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ 86
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 88
Приложение А (оценка повторяемости и воспроизводимости методики анализа)
105
Актуальность работы.
Соединения азота, в частности, оксид азота II (NO) и образующиеся после его окисления нитрит-ионы, а также его субстраты S-нитрозотиолы, играют важную роль в биохимических процессах организма. Особая роль этих соединений обусловлена, прежде всего, стимуляцией иммунной системы организма, которая распознает и уничтожает чужеродные тела и раковые клетки. Однако злокачественное новообразование способно к избеганию иммунологического надзора организма. Более того, клетки иммунной системы могут способствовать росту опухоли через индукцию иммуносупрессии противоопухолевых механизмов и усиление ангиогенеза. Существует ряд клеток иммунной системы, которые в зависимости от их функционального статуса могут быть связаны как опухолеподдерживающей, так и противоопухолевой активностью иммунной системы.
Макрофаги являются важными клетками системы врожденного иммунитета, выполняющими ряд функций, среди которых индукция иммунного ответа, регенерация тканей и т.д. В зависимости от выполняемой функции различным популяциям макрофагов присущи различные свойства [1]. Существует два типа макрофагов: М1 и М2-поляризованные формы [2,3]. Образование оксида азота в результате действия фермента индуцибельной NO-синтазы (iNOS), является одним из ключевых факторов, позволяющих различить М1 и М2 - поляризованные макрофаги [3,4,8]. Оксид азота является эффекторной молекулой, обуславливающей цитотоксичность М1 -поляризованных макрофагов [2,3,5], макрофаги М2 типа оксид азота не продуцируют [3,5].
Управление сигнальными путями, по которым образуются макрофаги М1 или М2 предоставит возможность манипулировать фенотипом и, прежде всего, функцией макрофага при раке, направляя их в сторону предпочтительного М1 -типа и улучшения исхода заболевания.
Известно также, что образование NO в организме человека может происходить посредством высвобождения этой молекулы из S-нитрозотиолов. Считается, что S-нитрозотиолы являются донорами NO и играют важную роль при транспортировке и выделении этой молекулы в организме человека [6-8]. Разнообразие биологических функций S-нитрозотиолов постоянно раскрывается. Таким образом, механизм разложения S-нитрозотиолов имеет большое значение для понимания биохимии организма человека.
Важным вопросом в этом является эффективная и быстрая система детекции оксида азота или продуктов его окисления в виде нитрит-ионов, а также в виде его субстратов S-нитрозотиолов, для фиксирования происходящих в клетке изменений.
На сегодняшний день в литературе имеется достаточное количество методов по определению нитрит-ионов. Однако, в биологических жидкостях их определение затруднено в связи с мешающим влиянием компонентов матрицы. Что касается S-нитрозотиолов, то до сих пор не существует золотого стандарта по определению этих соединений в биологических объектах. Это связано с тем, что в биологических средах количество нитрозотиолов варьируются от десятой нмоль до менее десяти мкмоль в литре. Несмотря на обилие исследований в этой области, представляется актуальным разработка новых, более простых и чувствительных методов для мониторинга метаболитов и субстратов оксида азота в биологических жидкостях.
На основании вышеизложенного, целью работы является исследование физико-химических закономерностей окисления-восстановления нитрит-ионов и S-нитрозотиолов на графитовом модифицированном электроде (ГМЭ) и разработка вольтамперометрических методик их количественного определения.
Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
1. Изучить физико-химические закономерности влияния различных факторов (рН фонового электролита, потенциала и времени накопления, скорости развертки потенциала) на процесс электроокисления нитрит-ионов на ГМЭ;
2. Разработать вольтамперометрическую методику определения нитрит- ионов как метаболитов оксида азота на ГМЭ для применения ее к биологическим жидкостям. Оценить метрологические характеристики методики;
3. Изучить мешающее влияние компонентов биологической матрицы на аналитический сигнал нитрит-ионов;
4. Провести сравнительное определение нитрит-ионов в надклеточных жидкостях М1 и М2 поляризованных макрофагов вольтамперометрическим и спектрофотометрическим методами;
5. Изучить физико-химические закономерности окисления-восстановления 8-Нитрозо-№ацетилпеницилламин (SNAP) как представителя S-нитрозотиолов на ГМЭ;
6. Разработать методику определения S-нитрозотиолов как субстратов оксида азота для применения ее к биологическим жидкостям. Оценить метрологические характеристики методики;
7. Провести сравнительное определение S-нитрозотиолов в крови человека вольтамперометрическим и флуориметрическим методами.
Научная новизна.
1. Исследованы закономерности электроокисления нитрит-ионов на ГМЭ. Разработан вольтамперометрический подход для экспрессного определения нитрит-ионов как метаболитов оксида азота в макрофагах, выделенных из моноцитов периферической крови человека.
2. Исследованы закономерности и предложен вероятный механизм электровосстановления S-Нитрозо-N-ацетилпеницилламина на поверхности ГМЭ. Показано, что процесс электровосстановления носит необратимый двухстадийный характер. Лимитирующая стадия процесса характеризуется переносом первого электрона.
3. Впервые разработан вольтамперометрический подход для экспрессного определения S-нитрозотиолов в модельных средах как субстратов оксида азота на ГМЭ. Проведена оценка метрологических характеристик методики. Разработанная методика применена для определения S-нитрозотиолов в биологических жидкостях.
Практическая значимость.
Разработанная вольтамперометрическая методика определения нитрит- ионов на ГМЭ применена для их определения как NO-метаболитов в надклеточных жидкостях макрофагов М1 и М2 типов. Проведена оценка метрологических характеристик методики. Результаты исследования показали принципиальную возможность использования разработанного вольтамперометрического метода для оценки содержания нитрит-ионов в супернатантах культуры индуцированных макрофагов для оценки их фенотипа.
Полученные результаты рекомендованы к применению в онкодиспансерах для оперативного мониторинга терапии онкологических заболеваний по содержанию NO-метаболитов в супернатантах моноцитов и макрофагов, выделенных из периферической крови человека. Экономическая эффективность внедряемой методики обусловлена простотой в использовании, низкой себестоимостью анализа, экспрессностью и высокой чувствительностью.
Разработана вольтамперометрическая методика экспрессного определения S- нитрозотиолов как субстратов оксида азота на ГМЭ, которая нашла применение для количественного обнаружения этих соединений в биологических жидкостях. Рассчитаны метрологические характеристики методики.
Положения, выносимые на защиту.
Результаты исследования влияния различных факторов (рН фонового электролита, потенциала и времени накопления, скорости развертки) на процесс электрохимического окисления нитрит-ионов на ГМЭ.
Результаты исследования влияния компонентов биологической матрицы на электрохимическое окисление нитрит-ионов.
Вольтамперометрическая методика определения нитрит-ионов на ГМЭ Метрологические характеристики методики.
Результаты исследования влияния различных факторов (рН фонового электролита, потенциала и времени накопления, скорости развертки потенциала) на процесс электрохимического восстановления З-Нитрозо-N-
ацетилпеницилламина как представителя S-нитрозотиолов на ГМЭ.
Вольтамперометрическая методика определения S-нитрозотиолов на ГМЭ в модельных средах. Метрологические характеристики методики.
Степень достоверности и апробация результатов.
Результаты работы были представлены и обсуждались на XVIII Международной научно-практической конференции студентов и молодых ученых имени профессора Л.П. Кулёва «Химия и химическая технология в XXI веке» (Томск, 2017); VI Международной научной конференции «Теоретическая и экспериментальная химия» (Караганда, 2017); XIX Международной научнопрактической конференции "Химия и химическая технология в XXI веке" студентов и молодых ученых имени профессора Л.П. Кулёва (Томск, 2018); 17 Международной конференции по электроанализу (ESEAC 2018), (Родос, 2018); 14 Международной научной конференции «Современные методы аналитической химии» (Прага, 2018); XX Международной научно-практической конференции «Химия и химическая технология в XXI веке» студентов и молодых ученых имени профессора Л.П. Кулёва (Томск, 2019); 7 Региональном симпозиуме по
электрохимии (RCE-SEE) и 8 симпозиуме Курта Швабе (Сплит, 2019); X Международной научной конференции «Современные методы в теоретической и экспериментальной химии» (Плес, 2019); 15 Международной научной конференции «Современные методы аналитической химии», (Прага, 2019).
Публикации.
По результатам работы опубликовано 3 статьи в журналах, 2 из которых в журнале, рекомендованном ВАК и входящем в базу данных Web of Science, и 1 статья в журнале 1 квартиля, индексируемом базой данных Scopus, а также 10 тезисов докладов.
Структура диссертации.
Диссертационная работа изложена на 122 страницах машинописного текста и включает 23 рисунка, 63 таблицы и список литературы состоящий из 158 источников.
Личный вклад автора состоял в изучении и систематизации литературных данных по методам выделения, определения NO-метаболитов и S-нитрозотиолов, а также в проведении экспериментальных исследований и интерпретации полученных данных.
Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ и ЧНФ в рамках научного проекта № 19-53-26001; Госзадания «Наука» № 4.5752.2017; Госзадания «Наука» № FSWW-2020-0022.
Соединения азота, в частности, оксид азота II (NO) и образующиеся после его окисления нитрит-ионы, а также его субстраты S-нитрозотиолы, играют важную роль в биохимических процессах организма. Особая роль этих соединений обусловлена, прежде всего, стимуляцией иммунной системы организма, которая распознает и уничтожает чужеродные тела и раковые клетки. Однако злокачественное новообразование способно к избеганию иммунологического надзора организма. Более того, клетки иммунной системы могут способствовать росту опухоли через индукцию иммуносупрессии противоопухолевых механизмов и усиление ангиогенеза. Существует ряд клеток иммунной системы, которые в зависимости от их функционального статуса могут быть связаны как опухолеподдерживающей, так и противоопухолевой активностью иммунной системы.
Макрофаги являются важными клетками системы врожденного иммунитета, выполняющими ряд функций, среди которых индукция иммунного ответа, регенерация тканей и т.д. В зависимости от выполняемой функции различным популяциям макрофагов присущи различные свойства [1]. Существует два типа макрофагов: М1 и М2-поляризованные формы [2,3]. Образование оксида азота в результате действия фермента индуцибельной NO-синтазы (iNOS), является одним из ключевых факторов, позволяющих различить М1 и М2 - поляризованные макрофаги [3,4,8]. Оксид азота является эффекторной молекулой, обуславливающей цитотоксичность М1 -поляризованных макрофагов [2,3,5], макрофаги М2 типа оксид азота не продуцируют [3,5].
Управление сигнальными путями, по которым образуются макрофаги М1 или М2 предоставит возможность манипулировать фенотипом и, прежде всего, функцией макрофага при раке, направляя их в сторону предпочтительного М1 -типа и улучшения исхода заболевания.
Известно также, что образование NO в организме человека может происходить посредством высвобождения этой молекулы из S-нитрозотиолов. Считается, что S-нитрозотиолы являются донорами NO и играют важную роль при транспортировке и выделении этой молекулы в организме человека [6-8]. Разнообразие биологических функций S-нитрозотиолов постоянно раскрывается. Таким образом, механизм разложения S-нитрозотиолов имеет большое значение для понимания биохимии организма человека.
Важным вопросом в этом является эффективная и быстрая система детекции оксида азота или продуктов его окисления в виде нитрит-ионов, а также в виде его субстратов S-нитрозотиолов, для фиксирования происходящих в клетке изменений.
На сегодняшний день в литературе имеется достаточное количество методов по определению нитрит-ионов. Однако, в биологических жидкостях их определение затруднено в связи с мешающим влиянием компонентов матрицы. Что касается S-нитрозотиолов, то до сих пор не существует золотого стандарта по определению этих соединений в биологических объектах. Это связано с тем, что в биологических средах количество нитрозотиолов варьируются от десятой нмоль до менее десяти мкмоль в литре. Несмотря на обилие исследований в этой области, представляется актуальным разработка новых, более простых и чувствительных методов для мониторинга метаболитов и субстратов оксида азота в биологических жидкостях.
На основании вышеизложенного, целью работы является исследование физико-химических закономерностей окисления-восстановления нитрит-ионов и S-нитрозотиолов на графитовом модифицированном электроде (ГМЭ) и разработка вольтамперометрических методик их количественного определения.
Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
1. Изучить физико-химические закономерности влияния различных факторов (рН фонового электролита, потенциала и времени накопления, скорости развертки потенциала) на процесс электроокисления нитрит-ионов на ГМЭ;
2. Разработать вольтамперометрическую методику определения нитрит- ионов как метаболитов оксида азота на ГМЭ для применения ее к биологическим жидкостям. Оценить метрологические характеристики методики;
3. Изучить мешающее влияние компонентов биологической матрицы на аналитический сигнал нитрит-ионов;
4. Провести сравнительное определение нитрит-ионов в надклеточных жидкостях М1 и М2 поляризованных макрофагов вольтамперометрическим и спектрофотометрическим методами;
5. Изучить физико-химические закономерности окисления-восстановления 8-Нитрозо-№ацетилпеницилламин (SNAP) как представителя S-нитрозотиолов на ГМЭ;
6. Разработать методику определения S-нитрозотиолов как субстратов оксида азота для применения ее к биологическим жидкостям. Оценить метрологические характеристики методики;
7. Провести сравнительное определение S-нитрозотиолов в крови человека вольтамперометрическим и флуориметрическим методами.
Научная новизна.
1. Исследованы закономерности электроокисления нитрит-ионов на ГМЭ. Разработан вольтамперометрический подход для экспрессного определения нитрит-ионов как метаболитов оксида азота в макрофагах, выделенных из моноцитов периферической крови человека.
2. Исследованы закономерности и предложен вероятный механизм электровосстановления S-Нитрозо-N-ацетилпеницилламина на поверхности ГМЭ. Показано, что процесс электровосстановления носит необратимый двухстадийный характер. Лимитирующая стадия процесса характеризуется переносом первого электрона.
3. Впервые разработан вольтамперометрический подход для экспрессного определения S-нитрозотиолов в модельных средах как субстратов оксида азота на ГМЭ. Проведена оценка метрологических характеристик методики. Разработанная методика применена для определения S-нитрозотиолов в биологических жидкостях.
Практическая значимость.
Разработанная вольтамперометрическая методика определения нитрит- ионов на ГМЭ применена для их определения как NO-метаболитов в надклеточных жидкостях макрофагов М1 и М2 типов. Проведена оценка метрологических характеристик методики. Результаты исследования показали принципиальную возможность использования разработанного вольтамперометрического метода для оценки содержания нитрит-ионов в супернатантах культуры индуцированных макрофагов для оценки их фенотипа.
Полученные результаты рекомендованы к применению в онкодиспансерах для оперативного мониторинга терапии онкологических заболеваний по содержанию NO-метаболитов в супернатантах моноцитов и макрофагов, выделенных из периферической крови человека. Экономическая эффективность внедряемой методики обусловлена простотой в использовании, низкой себестоимостью анализа, экспрессностью и высокой чувствительностью.
Разработана вольтамперометрическая методика экспрессного определения S- нитрозотиолов как субстратов оксида азота на ГМЭ, которая нашла применение для количественного обнаружения этих соединений в биологических жидкостях. Рассчитаны метрологические характеристики методики.
Положения, выносимые на защиту.
Результаты исследования влияния различных факторов (рН фонового электролита, потенциала и времени накопления, скорости развертки) на процесс электрохимического окисления нитрит-ионов на ГМЭ.
Результаты исследования влияния компонентов биологической матрицы на электрохимическое окисление нитрит-ионов.
Вольтамперометрическая методика определения нитрит-ионов на ГМЭ Метрологические характеристики методики.
Результаты исследования влияния различных факторов (рН фонового электролита, потенциала и времени накопления, скорости развертки потенциала) на процесс электрохимического восстановления З-Нитрозо-N-
ацетилпеницилламина как представителя S-нитрозотиолов на ГМЭ.
Вольтамперометрическая методика определения S-нитрозотиолов на ГМЭ в модельных средах. Метрологические характеристики методики.
Степень достоверности и апробация результатов.
Результаты работы были представлены и обсуждались на XVIII Международной научно-практической конференции студентов и молодых ученых имени профессора Л.П. Кулёва «Химия и химическая технология в XXI веке» (Томск, 2017); VI Международной научной конференции «Теоретическая и экспериментальная химия» (Караганда, 2017); XIX Международной научнопрактической конференции "Химия и химическая технология в XXI веке" студентов и молодых ученых имени профессора Л.П. Кулёва (Томск, 2018); 17 Международной конференции по электроанализу (ESEAC 2018), (Родос, 2018); 14 Международной научной конференции «Современные методы аналитической химии» (Прага, 2018); XX Международной научно-практической конференции «Химия и химическая технология в XXI веке» студентов и молодых ученых имени профессора Л.П. Кулёва (Томск, 2019); 7 Региональном симпозиуме по
электрохимии (RCE-SEE) и 8 симпозиуме Курта Швабе (Сплит, 2019); X Международной научной конференции «Современные методы в теоретической и экспериментальной химии» (Плес, 2019); 15 Международной научной конференции «Современные методы аналитической химии», (Прага, 2019).
Публикации.
По результатам работы опубликовано 3 статьи в журналах, 2 из которых в журнале, рекомендованном ВАК и входящем в базу данных Web of Science, и 1 статья в журнале 1 квартиля, индексируемом базой данных Scopus, а также 10 тезисов докладов.
Структура диссертации.
Диссертационная работа изложена на 122 страницах машинописного текста и включает 23 рисунка, 63 таблицы и список литературы состоящий из 158 источников.
Личный вклад автора состоял в изучении и систематизации литературных данных по методам выделения, определения NO-метаболитов и S-нитрозотиолов, а также в проведении экспериментальных исследований и интерпретации полученных данных.
Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ и ЧНФ в рамках научного проекта № 19-53-26001; Госзадания «Наука» № 4.5752.2017; Госзадания «Наука» № FSWW-2020-0022.
1. Исследован процесс модификации поверхности графитового электрода углеродными чернилами различных производителей. Показано, что после модификации происходит увеличение электроактивной поверхности электрода. Модификатор, дающий равномерную пленку с более разветвленной поверхностью получен из микрокристаллического графита производства Sigma-Aldrich.
2. Исследованы физико-химические закономерности электроокисления нитрит-ионов и подобраны условия вольтамперометрического определения на ГМЭ. Показано, что процесс носит необратимый характер в универсальном буферном растворе БР с рН 4,02 при Етк = 0,4 В, /нак = 4 с, v = 100 мВ/с.
3. Разработана методика определения нитрит-ионов на ГМЭ. Проведена оценка основных метрологических характеристик разработанной методики.
4. Изучено мешающее влияние компонентов биологической матрицы на аналитический сигнал нитрит-ионов. Показано, что 50-кратный избыток 10 % телячьей сыворотки и 100-кратный избыток остальных компонентов биологической жидкости не оказывает существенного влияния на сигнал электроокисления нитрит-ионов.
5. Проведено сравнительное определение нитрит-ионов в надклеточных жидкостях М1 и М2 поляризованных макрофагов вольтамперометрическим спектрофотометрическим методами. Показано, что уровень нитрит-ионов в надклеточных жидкостях макрофагов, полученных из моноцитов периферической крови человека, может служить маркером для определения преимущественного фенотипа макрофагов (М1 или М2) в организме человека.
6. Изучены физико-химические закономерности, а также вероятный механизм восстановления S-нитрозотиолов на ГМЭ на примере SNAP. Показано, что процесс носит необратимый характер при участии двух электронов в фосфатном буферном растворе с рН 7,4 при Енак = -0,6 В, /нак = 30 с, v = 80 мВ/с.. Лимитирующая стадия процесса характеризуется переносом первого электрона.
7. Разработана методика вольтамперометрического определения SNAP на ГМЭ и оценены основные метрологические характеристики методики.
8. Проведена оценка эндогенного нитрозотиола в крови. Найденные концентрации нитрозотиолов в крови согласуются с зарегистрированными концентрациями, указанными в литературных источниках.
2. Исследованы физико-химические закономерности электроокисления нитрит-ионов и подобраны условия вольтамперометрического определения на ГМЭ. Показано, что процесс носит необратимый характер в универсальном буферном растворе БР с рН 4,02 при Етк = 0,4 В, /нак = 4 с, v = 100 мВ/с.
3. Разработана методика определения нитрит-ионов на ГМЭ. Проведена оценка основных метрологических характеристик разработанной методики.
4. Изучено мешающее влияние компонентов биологической матрицы на аналитический сигнал нитрит-ионов. Показано, что 50-кратный избыток 10 % телячьей сыворотки и 100-кратный избыток остальных компонентов биологической жидкости не оказывает существенного влияния на сигнал электроокисления нитрит-ионов.
5. Проведено сравнительное определение нитрит-ионов в надклеточных жидкостях М1 и М2 поляризованных макрофагов вольтамперометрическим спектрофотометрическим методами. Показано, что уровень нитрит-ионов в надклеточных жидкостях макрофагов, полученных из моноцитов периферической крови человека, может служить маркером для определения преимущественного фенотипа макрофагов (М1 или М2) в организме человека.
6. Изучены физико-химические закономерности, а также вероятный механизм восстановления S-нитрозотиолов на ГМЭ на примере SNAP. Показано, что процесс носит необратимый характер при участии двух электронов в фосфатном буферном растворе с рН 7,4 при Енак = -0,6 В, /нак = 30 с, v = 80 мВ/с.. Лимитирующая стадия процесса характеризуется переносом первого электрона.
7. Разработана методика вольтамперометрического определения SNAP на ГМЭ и оценены основные метрологические характеристики методики.
8. Проведена оценка эндогенного нитрозотиола в крови. Найденные концентрации нитрозотиолов в крови согласуются с зарегистрированными концентрациями, указанными в литературных источниках.