Тема: ЗАКОНОМЕРНОСТИ ФОРМИРОВАНИЯ, СТРУКТУРНЫЕ ОСОБЕННОСТИ И СВОЙСТВА КОМПОЗИТНЫХ СКЭФФОЛДОВ НА ОСНОВЕ ПОЛИКАПРОЛАКТОНА И МОДИФИЦИРОВАННОГО ГИДРОКСИАПАТИТА, СФОРМИРОВАННЫХ МЕТОДОМ ЭЛЕКТРОФОРМОВАНИЯ

Актуальность темы диссертации. Проблема, связанная с восстановлением и лечением поврежденных костных тканей организма человека, обусловлена комплексом социальных и физиологических причин. Традиционные подходы, в основе которых лежит лечение дефектов ауто-, гомологичными или металлическими материалами, имеют ряд недостатков и сложно устранимых ограничений. В наши дни существует огромная потребность в разработке новых способов получения биокомпозитов с заданными свойствами, позволяющих более эффективно управлять процессами регенерации костных тканей и сократить срок реабилитационного периода, что является одним из важнейших подходов медицинского материаловедения, включающих основные аспекты физики конденсированного состояния.
Одним из перспективных направлений данной области является разработка и исследование структуры и свойств биокомпозитных скэффолдов (конструкций, матриц), обладающих заданным набором физико-химических и эксплуатационных свойств. Скэффолды имитируют внеклеточный костный матрикс (ВКМ), и используются для направленного восстановления структуры и функциональности поврежденной или утраченной костной ткани. Основными требованиями при выборе материалов и методов, для создания такого рода конструкций являются: биосовместимость используемых биоматериалов; оптимальная скорость их
биодеградации, соответствующая росту собственной костной ткани; нетоксичность продуктов распада; наличие адгезивной поверхности, способствующей прикреплению и пролиферации клеток; структура и пористость, способствующая распределению клеток в объеме скэффолда, образованию кровеносных сосудов, доставке питательных веществ и удалению продуктов жизнедеятельности.
Лидирующее место среди множества биоматериалов, используемых для создания скэффолдов, занимает гидроксиапатит (ГА), благодаря его сходству по элементному и фазовому составу с костной тканью. Введение следовых элементов в кристаллическую решетку ГА, содержащихся в структуре костной ткани, в частности, катионов Sr2+ или анионов SiO44-, является важным этапом на пути создания биокомпозитов с улучшенными свойствами, так как позволяет управлять процессами биорастворения, ускорять процессы биоминерализации и остеоинтеграции конструкции в области дефекта, а также персонализировано решать проблемы, связанные с лечением костных тканей. Однако, низкая растворимость ГА в биологических жидкостях организма, а также высокая хрупкость, ограничивает применение данного биоматериала в чистом виде для создания скэффолдов. Ввиду того что костная ткань - это композитный материал, состоящий из ГА и природного коллагена, использование его в качестве наполнителя или модификатора матрицы-основы, которая зачастую выполняется из биополимера, является перспективным подходом для создания подобного рода конструкции с оптимальным и заданным набором свойств. В качестве биоматериала основы конструкции может использоваться зарекомендовавший себя полиэфир - поликапролактон (ПКЛ), ввиду его биосовместимости, оптимальной для костной ткани скорости биодеградации (2-3 года) и нетоксичности продуктов распада, а также высокой механической прочности.
Одним из технологически удобных, финансово доступных и эффективных методов, позволяющих формировать скэффолды, по нашему мнению, является электроформование (ЭФ). Так как функциональность конструкций существенным образом определяется несколькими свойствами, которые включают структуру, фазовый и химический состав, то путем варьирования технологических параметров процесса ЭФ и состава технологической смеси, можно управлять этими свойства.
Таким образом, в настоящем диссертационном исследовании реализован новый подход, заключающийся в разработке технологии получения скэффолдов на основе ПКЛ, обогащенных ГА с изоморфными замещениями, ионами Sr2+ или SiO44', которые обладают требуемым сочетанием физико-химических, эксплуатационных и технологических свойств, способствующих ускоренной регенерации поврежденных костных тканей. Выявление закономерностей, определяющих достижение заданных свойств композитных скэффолдов, представляет значительный научный и практический интерес.
Степень разработанности темы исследования. В настоящее время активно ведутся работы, посвященные разработке технологии получения композитных скэффолдов на основе ГА, как зарубежными, так и российскими учеными. Известны работы, в которых представлены исследования скэффолдов, модифицированных чистым ГА различной концентрации [1-4]. Меньше, но также существуют работы, посвященные созданию скэффолдов на основе ГА с различными катионными и анионными замещениями [5,6]. Данный факт отчетливо свидетельствует о перспективности данного направления исследований. В опубликованных работах продемонстрирована принципиальная возможность создания скэффолдов методом ЭФ, состоящих из случайным образом ориентированных нановолокон, модифицированных наночастицами ГА и его изоморфными разновидностями. Тем не менее такие конструкции не нашли широкого применения в медицинской практике ввиду нановолокнистой структуры, которая отличается недостаточной прочностью и препятствует проникновению во внутреннее пространство скэффолда костных клеток. Кроме того, на данный момент нет работ, направленных на изучение влияния концентрации ГА, в том числе с различными катионными и анионными замещениями, на морфологию, структуру, фазовый и химический состав композитных скэффолдов с беспорядочно и упорядоченно ориентированными микроволокнами, имитирующими физическую структуру костной ткани, что обеспечивает прочность конструкции и сохранность ее формы в процессе имплантации. Данный факт является важным этапом на пути интеграции скэффолдов в медицинскую практику. Так как внутренняя структура во многом определяет взаимодействие скэффолда с окружающей средой организма, этому вопросу в данной работе уделяется особое внимание.
Цель диссертационного исследования состоит в установлении закономерностей получения композитных скэффолдов на основе поликапролактона и модифицированного гидроксиапатита, сформированных методом электроформования.
Для достижения поставленной цели в диссертации были сформулированы и решены следующие задачи:
1. Изучить элементный, фазовый и молекулярный состав поликапролактона и микрочастиц порошков-прекурсоров модифицированного гидроксиапатита, определить влияние ионов Sr2+ или SiO44- на удельную поверхность дисперсных систем.
2. Изучить закономерности формирования скэффолдов из поликапролактона методом ЭФ в зависимости от параметров технологического процесса и получить композитные скэффолды на основе поликапролактона и гидроксиапатита, модифицированного Sr2+ или SiO44- ионами, с беспорядочно или упорядоченно ориентированными волокнистыми структурами; установить влияние способов получения скэффолдов на их структуру и морфологию.
3. Выявить закономерности формирования структурно-морфологических и физикохимических свойств композитных скэффолдов в зависимости от массовой доли микрочастиц стронций- или кремнийзамещенного гидроксиапатита.
4. Исследовать смачиваемость поверхности и свободную поверхностную энергию композитных скэффолдов с различной концентрацией микрочастиц порошков-прекурсоров Sr- или Si-замещенного гидроксиапатита.
5. Определить механизм биодеградации композитных скэффолдов в модельном биологическом растворе натрий фосфатного буфера (phosphate buffered saline - PBS).
6. Провести биологические исследования in vitro на цитотоксичность, биоактивность и определить влияние катионов Sr2+ или анионов SiO44- в структуре ГА на жизнеспособность и жизнедеятельность клеточных культур.
Научная новизна. В работе впервые:
1. Разработан способ получения композитных скэффолдов с микроструктурой, состоящей из беспорядочно (0- 180о) или упорядоченно (60-120о) ориентированных относительно оси z полярной системы координат волокон с мультимодальным распределением по диаметру, модифицированных, в частности, микрочастицами гидроксиапатита, содержащим ионы Sr2+ или SiO44-.
2. Установлены физико-химические закономерности формирования композитных скэффолдов методом электроформования, состоящих из полимерных волокон, модифицированных Sr- или Si-замещенным гидроксиапатитом. Наличие микроагломератов порошков-прекурсоров в полимерной матрице приводит к увеличению разброса диаметра волокон в диапазоне 0,2-30 мкм за счет встраивания микрочастиц стронций- или кремнийзамещенного гидроксиапатита объемом 1—104 мкм3 в их структуру; увеличение концентрации стронций- или кремнийзамещенного гидроксиапатита от 10 до 15 мас.% приводит к увеличению фазы модифицированного гидроксиапатита в структуре полимерного скэффолда; удельная поверхность микрочастиц порошков-прекурсоров, размер и ориентация волокон определяют пористость скэффолдов.
3. Показано, что добавление 15 мас.% Sr- или Si-замещенного гидроксиапатита в чистую полимерную матрицу приводит к уменьшению ее гидрофобности и увеличению поверхностной энергии от ~ 5 до 30 и 32 мДж/м2 (беспорядочно ориентированные волокна) и от ~ 3 до 43 и 47 мДж/м2 (упорядоченно ориентированные волокна) за счет полярной составляющей, благодаря наличию молекулярных PO43- и OH- групп в структуре гидроксиапатита.
4. Установлено влияние Sr- или Si-замещенного гидроксиапатита модификаторов в полимерной матрице на механизмы биодеградации скэффолдов в модельной биологической среде (PBS). Установлено, что различная степень биодеградации конструкций связана с влиянием их морфологии, структуры и химического состава.
Практическая значимость работы. Сформированные методом электроформования композитные скэффолды, модифицированные гидроксиапатитом с катионным замещением ионами Sr2+ или анионным замещением ионами SiO44— с беспорядочно или упорядоченно ориентированными волокнистыми структурами, обладают улучшенной биоактивностью, биорезорбируемостью и имеют потенциал применения в качестве готового продукта в персонифицированной медицине. Полученные в диссертационной работе результаты могут в дальнейшем быть использованы при разработке технологий синтеза скэффолдов на основе полимерных биоматериалов, включающих различные изоморфные разновидности ГА, обладающие заданным набором физико-химических и эксплуатационных свойств.
Методология и методы исследования. Методология диссертации основана на комплексном и системном подходе к анализу современных проблем в области создания биосовместимых материалов с использованием эффективных методов исследования.
В диссертационной работе были использованы следующие методы исследования: рентгенофазовый анализ, инфракрасная спектроскопия, оптическая микроскопия, сканирующая электронная микроскопия, энергодисперсионный рентгеновский анализ, высокоразрешающая компьютерная томография с использованием источника синхротронного излучения, а также методы исследования смачиваемости, поверхностной энергии, и механических характеристик. Медико-биологическое обоснование применения композитных скэффолдов выполнено с использованием методик исследования на биодеградацию и биосовместимость в условиях in vitro и in vivo.
Научные положения диссертации, выносимые на защиту:
1. Закономерности получения дисперсно-наполненных композитных скэффолдов на основе стронций- или кремний-замещенного гидроксиапатита методом электроформования с заданной беспорядочно (0- 180о) или упорядоченно (60-120о) ориентированной микроархитектурой волокон относительно оси z, проходящей через центр полярной системы координат, со средним диаметром ~ 5,5 мкм, обеспечиваются набором следующих основных параметров технологического процесса: граничными значениями концентрации порошка-прекурсора (5-15 мас.%), вязкостью технологической смеси (1,61:2,30 Пахсек), электрическим напряжением - 8 кВ, расходом композитного раствора - 1 мл/час, межэлектродным расстоянием - 7 см и скоростью вращения коллектора - 600 или 1000 об/мин.
2. Повышение концентрации дисперсного наполнителя в виде стронций- или кремний-
замещенного гидроксиапатита в структуре полимерного скэффолда от 10 до 15 мас.% приводит к увеличению фазы гидроксиапатита, снижению среднего диаметра волокон на ~ 17%, росту среднего диаметра микрочастиц на ~ 8% и изменению средней пористости на ~ 7%,
соответственно.
3. Композитные скэффолды, содержащие 15 мас.% микрочастиц стронций- или кремний- замещенного гидроксиапатита, обладают более высокой скоростью биодеградации (в среднем на 1,8±0,6%) в сравнении с немодифицированными и модифицированными с помощью 10 мас.% микрочастиц скэффолдами, за счет улучшенной смачиваемости благодаря повышению поверхностной энергии (в среднем от 4,1±1,2 до 37,9±8,8 мДж/м2), определяющий вклад в значение которой вносят ковалентные полярные P-O и O-H связи.
Достоверность результатов представленных в диссертации подтверждается их согласованностью, применением комплекса современных взаимодополняющих методов исследования и статистической обработки, а также сопоставления полученных результатов с имеющимися литературными источниками.
Апробация работы. Основные результаты диссертации докладывались и обсуждались на следующих конференциях и школах-семинарах: Международной научно-практической конференции студентов и молодых учёных «Современные техника и технологии» (Россия, г. Томск, 2013), Международной X конференции студентов и молодых ученых «Перспективы развития фундаментальных наук» (Россия, г. Томск, 2013, 2016), III Международной научнопрактической конференции «Новые технологии создания и применения биокерамики в восстановительной медицине» (Россия, г. Томск, 2013, 2016), I Всероссийском конкурсе докладов студентов «Функциональные материалы: разработка, исследование, применение» (Россия, г. Томск, 2013), Конкурсе научных работ в рамках Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы биомедицинской инженерии» (Россия, г. Саратов, 2013), Всероссийской молодежной научной конференции с международным участием «Инновации в материаловедении» (Россия, г. Москва, 2013), XIX Международной Пущинской школе- конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Россия, г. Пущино, 2015), 27th European Conference on Biomaterials ESB 2015 (Польша, г. Краков, 2015), II International Biennial Conference «Biomaterials and Novel Technologies for Healthcare» (Италия, г. Рим, 2016), V Международной научной конференции для молодых ученых, студентов и школьников «Наноматериалы и нанотехнологии: проблемы и перспективы» (Россия, г. Саратов, 2016), V Международной научно-технической конференции молодых ученых, аспирантов и студентов «Высокие технологии в современной науке и технике» (Россия, г. Томск, 2016), The RACIRI Summer School «Convergent Science and Technology for Society» (Россия, Репино, 2016), XVIII Международной научно-практической конференции студентов и молодых ученых «Химия и химическая технология в XXI веке» (Россия, Томск, 2017), XI Международной конференция по микроциркуляции и гемореологии (Россия, Ярославль, 2017), 2017 Annual Meeting and Exposition of the Society for Biomaterials (США, Миннесота, 2017), VI Международной научной конференции «Новые оперативные технологии» (Россия, Томск, 2017), XXV Международная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов» (Россия, Москва, 2018), The 14th Biennial Conference on High-Resolution X-ray Diffraction and Imaging (Италия, Бари, 2018).
Публикации. Результаты диссертационной работы представлены в 27 научных публикациях, из них 11 статей входящих в базу данных SCOPUS и Web of Science, из которых 4 статьи в журналах из перечня ВАК, 1 патент.
Личный вклад автора заключается в анализе литературных данных, посвященных разработке и исследованию композитных скэффолдов, в постановке цели и задач диссертационной работы, планировании и проведении экспериментальных исследований, и анализе полученных данных, формулировке выводов и положений, выносимых на защиту, подготовке публикаций и докладов по теме работы.
Работа выполнена при финансовой поддержке Федеральной целевой программы № 14.587.21.0013 (уникальный идентификатор проекта 2015-14-588-0002-5599, проект
INTELBIOCOMP), Госзадание «Наука» №11.1233.2017/4.6 «Исследование физических механизмов получения новых типов композитных скэффолдов с пьезоэлектрическим эффектом и поверхностным потенциалом для регенеративной медицины» (2017 г.), грант Президента для поддержки молодых ученых кандидатов наук МК-6287.2018.8 «Получение трехмерных гибридных биодеградируемых скэффолдов на основе различных комбинаций проводящего полианилина и пьезополимеров, с различными по величине и полярности значениями поверхностного заряда (потенциала)» (2018-2019 гг.).
Структура и объём диссертационной работы. Диссертация состоит из введения, пяти глав и заключения с выводами, изложенных на 143 страницах машинописного текста, включая 62 рисунков, 11 таблиц и список используемой литературы, из 213 наименований.
Во введении обоснована актуальность темы диссертационного исследования, показана степень ее разработанности, определена цель работы и задачи, решение которых необходимо для достижения поставленной цели, сформулирована научная новизна и ценность исследования, показана практическая значимость, описана методология и методы исследования, сформулированы выносимые на защиту положения, обоснована достоверность результатов, приведены сведения об апробации работы, публикациях и приведено краткое содержание глав диссертации.
В первой главе приведены основные принципы тканевой инженерии, представлены требования к разработке скэффолдов и краткий обзор основных биоматериалов и методов, позволяющих формировать скэффолды, рассмотрены физические принципы и закономерности формирования скэффолдов методом ЭФ.
Во второй главе представлено описание экспериментального оборудования и даны характеристики исходных материалов, используемых для создания скэффолдов, описаны методики экспериментальных исследований.
В третьей главе приведены результаты оптимизации способа получения композитных скэффолдов методом ЭФ, установлена зависимость между структурно-морфологическими характеристиками скэффолдов и параметрами технологического процесса, изучен фазовый, молекулярный и элементный составы исходных материалов, определено влияние ионов Sr2+ и SiO44- на дисперсность порошков-прекурсоров, проведена биологическая аттестация композитных скэффолдов с беспорядочно ориентированной волокнистой структурой, содержащих минимальную (5 мас.%) концентрацию порошка-прекурсора.
Четвертая глава посвящена исследованию закономерностей формирования структурноморфологических и физико-химических свойств композитных скэффолдов с беспорядочно и упорядоченно ориентированной структурой волокон в зависимости от массовой доли модифицированных ГА порошков с изоморфными замещениями ионами Sr2' или SiO44-.
Пятая глава посвящена исследованию влияния массовой доли модификаторов в полимерной матрице на физико-механические и биологические свойства, а также биодеградацию.
Благодарности. Автор выражает искреннюю благодарность руководителю к.ф.-м.н. Р.А. Сурменеву за участие в обсуждении полученных результатов и помощь в подготовке диссертационной работы; к.ф.-м.н. М.А. Сурменевой за помощь в организации экспериментов; Д.С. Сыромотиной, Е.В. Мельник и А.С. Звягину за помощь в приготовлении экспериментальных образцов и участие в выполнении экспериментов; к.ф.-м.н. А.А. Ивановой, А.А. Шароновой, И.Ю. Грубовой за ценные замечания и комментарии по работе. Также, немецким коллегам: профессору Т. Баумбаху, Др. В. Вайнхардт, Р.В. Шкарину, Др. А. Чечилии, А.В. Шкарину за дружественный прием, неоценимую помощь и поддержку, а также ценные идеи и замечания в проведении томографических исследований композитных скэффолдов. к.м.н. И.И. Селезневу и к.м.н. В.В. Зайцева за помощь в проведении биологических экспериментов. А также, огромное спасибо моей маме за моральную поддержку и содействие в завершении диссертационного исследования.

Купить

1. Механохимически синтезированные порошки стронций- и кремнийзамещенного гидроксиапатита характеризуются:
- однофазной структурой, изовалентное Sr2+ и гетеровалентное SiO44- замещения приводят к увеличению объема кристаллической решетки гидроксиапатита и изменению размера кристаллитов;
- одномодальным распределением размеров зерен, при этом удельная поверхность
дисперсных систем уменьшается в следующем ряду: кремнийзамещенный
гидроксиапатит > гидроксиапатит > стронцийзамещенный гидроксиапатит.
2. Экспериментально показано, что стабильность технологического процесса электроформования при создании композитных дисперсно-наполненных скэффолдов с беспорядочно и упорядоченно ориентированными относительно оси z, проходящей через центр полярной системы координат микроволокнами, достигается путем использования концентрации порошка прекурсора 5~15 мас.%, при вязкости технологической смеси 1,61^2,30 Пахсек, и следующих параметрах технологического процесса: электрическое напряжение - 8 кВ, расход композитного раствора - 1 мл/час, межэлектродное расстояние - 7 см, скорость вращения коллектора - 600 или 1000 об/мин.
3. Полученные композитные скэффолды характеризуются би- и мультимодальной пористой микроархитектурой. Повышение концентрации дисперсных наполнителей в виде Sr- или Si- замещенного гидроксиапатита в структуре полимерной матрицы от 10 до 15 мас.% приводит к увеличению фазы гидроксиапатита и количества Sr и Si элементов в скэффолдах от 5,8 до 7,6 ат. % и от 4,5 до 5,7 ат.%, соответственно, а также увеличению диапазона распределения диаметра волокон за счет встраивания микрочастиц диаметром 1,0-21,5 мкм во внутреннюю структуру полимерных волокон. Показано, влияние концентрации микрочастиц Sr- или Si-замещенного гидроксиапатита и ориентации микроволокнистых структур на пористость композитных скэффолдов.
4. Экспериментально установлено, что увеличение скорости биодеградации композитных скэффолдов, содержащих 15 мас.% дисперсных наполнителей в виде Sr- или Si-замещенного гидроксиапатита в среднем на 1,8±0,6% в сравнении с немодифицированными и модифицированными с помощью 10 мас.% микрочастиц скэффолдами обусловлено улучшенной смачиваемостью благодаря повышению значения поверхностной энергии (в среднем от 4,1±1,2 до 37,9±8,8 мДж/м2), определяющий вклад в значение которой вносят полярные химические P- O и O-H связи замещенного ГА.
5. Биологическая апробация в условиях in vitro показала, что скэффолды, содержащие 15 мас.% Sr- или Si-замещенного гидроксиапатита с упорядоченно ориентированными микроструктурами не оказывают токсического воздействия. Они показали наиболее высокую жизнеспособность клеточных культур на поверхности образцов среди всей выборки. При анализе экспрессии генов установлено, что SiГА-содержащие скэффолды более интенсивно активируют ALPL и BGLAP гены, отвечающие за метаболическую активность костных клеток, в то время как SrГА-содержащие скэффолды способствуют более эффективной выработке RUNX2, IGF1, IGFR1, COL1A1, CD34 генов, что способно благотворно влиять на заживление поврежденных костных тканей c остеопоротическими изменениями.

Купить