Реферат 2
Введение 5
1 Обзор литературы 7
1.1 Биоразрушаемые полимеры 7
1.2 Политиоэфиры 10
1.3 Полигидроксиалканоаты, их свойства и применение 12
1.3.1 Структура и классификация ПГА 15
1.4 Среднецепочечные ПГА: химическая структура и биосинтез 17
1.4.1 Химические и физические свойства ПГА 17
1.4.2 Биохимические пути синтеза ПГА 18
1.5 Субстраты, используемые для получения ПГА 21
1.6 Условия роста бактерий и накопления полимера. Периодические системы
и периодические системы с подпиткой 21
2 Объект и методы исследований 22
2.1 Водородные бактерии Cupriavidus eutrophus 22
2.2 Материалы и методы исследования 24
2.2.1 Культивирование бактерий и методы измерения параметров
культивирования 24
2.3 Измерение биохимических характеристик 25
2.3.1 Определение концентрации фруктозы 25
2.3.2 Определение содержания аммонийного азота 26
2.3.3 Определение содержания в клетках состава ПГА 27
2.3.4 Определение концентрации органических кислот в культуральной
среде 27
2.3.5 Определение физических свойств (поли(3ГБ-со-3МП)) 27
2.4 Статистическая обработка данных 28
3 Результаты исследований и их обсуждениеОшибка! Закладка не определена.
3.1 Синтез сополимеров П(3-ГБ-со-3-МП) штаммом C. eutrophus В10646 при добавлении 3-меркаптопропионовой кислоты (3МПК) в разных концентрацияхОши£
Заключение 29
Список использованных источников 30
Синтетические полимеры получили широкое распространение с середины 1940-х годов, и уже в скором времени заменили такие материалы, как стекло, дерево и даже металл и тем самым стали играть существенную роль в промышленности, экономике и оказывать влияние на состояние окружающей среды [1]. Столь широкое распространение пластмасс связано с их физико-химическими свойствами, а именно с их стабильностью и прочностью. С другой стороны, пластики используются в качестве так называемых «короткоживущих» материалов и используются, например, для создания упаковок, тары, бытовых и гигиенических изделий [2]. Однако из-за устойчивости пластмасс в окружающей среде увеличивается количество отходов. Сложившаяся ситуация повысила интерес к биоразрушаемым материалам как альтернативе традиционным пластикам.
Биоразрушаемые полимеры открыли путь для разработки стратегий по ликвидации полимерных отходов. Наиболее активно изучаемыми среди биоразрушаемых пластиков являются алифатические полиэфиры, в том числе бактериального происхождения, так называемые полигидроксиалканоаты (ПГА) [3; 4; 5; 6; 7; 8].
Широкое разнообразие бактерий накапливает оптически активный полимер ((R) -3 гидроксимасляную кислоту) в качестве хранения
внутриклеточного материала и как источника углерода и энергии. Поли ((R) -3- гидроксибутират) П(3ГБ), выделенный из бактерий, является биоразлагаемым и биосовместимым термопластом с температурой плавления около 180 ° С. Бактериальный П(3ГБ) рассматривается в качестве промышленного экологически разлагающегося пластика для широкого спектра медицинской, морской, и сельскохозяйственной деятельности. Тем не менее, существует ряд недостатков бактериального П(3ГБ), рассматриваемого в качестве инженерного материала; ему присущи хрупкость и термическая нестабильность выше точки плавления [9]. В последнее время исследуется
синтез сополимеров, состоящих из 3ГБ и блоков 3-меркаптопропионовой кислоты. Эти микробные гомополиэфиры и сополиэфиры, содержащие в основной цепи серу, были предоставлены в качестве представителя восьмого класса биополимеров [10]. Микробные терполиэфиры - интересный материал из-за их различных химических и физических свойств по сравнению с соответствующими сополиоксоэфирами и терпооксоэфирами [11]. Сообщается, что термическая стабильность у политиоэфиров лучше, чем у полиоксиэфиров[12]. Таким образом, для терполиэфиров можно ожидать дальнейшего роста точки плавления или термического разложения, чего нельзя сказать об их кислородных аналогах [13]. Одним из таких сополимеров, представляющих интерес для исследований, является поли(3-гидроксибутират- со-3-меркаптопропионат) .
Целью настоящей работы было изучение возможности получения сополимеров поли(3-гидроксибутирата-со-3-меркаптопропионата) с
использованием водородокисляющих бактерий Cupriavidus eutrophus B10646.
Для достижения цели сформулированы следующие задачи:
1. Исследовать возможность синтеза сополимера
поли(3гидроксибутирата-со-3-меркаптопропионата) водородокисляющими
бактериями Cupriavidus eutrophus B10646;
2. Исследовать влияние 3-меркаптопропионовой кислоты на урожай полимера и биомассы;
3. Синтезировать образцы сополимера (3-ГБ-СО-3-МП) с различным соотношением мономеров и изучить физико-химические свойства.
В ходе работы были исследованы рост и накопление полимера у бактерий С. eutrophus штамм В10646. Установлено, что исследуемый штамм способен синтезировать сополимер поли(3-гидроксибутирата-со-3-
меркаптопропионата (поли(3-ГБ-со-3-МП)) в гетеротрофных условиях при условии добавления в культуру 3МПК (предшественника для синтеза мономеров 3-МП).
При проведении экспериментальных исследований установлено, что 3МПК в концентрации до 1 г/л не оказывает ингибирующего действия на рост бактерий и синтез полимера, а её добавление в культуру в найденных концентрациях обеспечивает условия для эффективного синтеза сополимеров 3-гидроксибутирата-со-3-меркаптопропионата с высоким содержанием фракции 3-меркаптопропионата (до 38 мол. %).
Таким образом, в результате синтезированы образцы полимера с 3 - меркаптопропионатом, изучены физико-химические свойства полученного сополимера поли(3-ГБ-со-3-МП). Установлено, что добавление 3МПК приводит к синтезу сополимеров с более высокой полидисперсностью. Показано, что для сополимеров поли(3-ГБ-со-3-МП) характерно два пика плавления.
1. Cain, R.B. Microbial degradation of synthetic polymers / In: Frey J.C., Gadd G.M., Herbert R.A., Jones C.W., Watson-Craik I.A. // 48 symposium of the society for general microbiology (University of Cardiff, March 1992): Bath. Press. - UK, 1992. - P. 293-338.
2. Witt, U. Biodegradation of polyester copolymers containing aromatic compounds / U. Witt, R.J. Meller, J. Klein // J.M.S. Pure Appl. Chem., 1997. - V. 32. - P. 851-856.
3. Anderson, A.J. Occurrence, metabolism, metabolic role, and industrial uses of bacterial polyhydroxyalkanoates / A.J. Anderson, E.A. Dawes // Microbiol. Rev., 1990. - V. 54. - P. 450-472.
4. Doi, Y. Biodegradation of microbial copolyesters: poly(3- hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) and poly(3-hydroxybutyrate-co-4- hydroxyvalerate) / Y. Doi, M. Kunioka // Macromolecules, 1990. - V. 23. - P. 26-31.
5. Augusta, J. A rapid evaluation plate-test for the biodegrability of plastics / J. Augusta, H. Widdecke // Appl. Microbiol. Biotechnol., 1993. - V. 39. - P. 673¬678.
6. Marchessault, R.H. Chemical, enzymatic and microbial degradation of bacterial and synthetic poly-R-hydroxyalkanoates / R.H. Marchessault, C.J. Monasterios, J.J. Jesudason, B. Ramsay, I. Saracovan, B. Saito // Polym. Degrad. Stab., 1994. - V. 45. - P. 187-196.
7. Jendrossec, D. Biodegradation of polyhydroxyalkanoic acids / D. Jendrossec, A. Schirmer, H.G. Schlegel // Appl. Microbiol. Biotechnol., 1996. - V. 46. - P. 451-463.
8. Mergeart, J. Biodiversity of microorganisms that degrade bacterial and synthetic polyesters / J. Mergeart, J. Swings // Microbiol., 1996. - V. 17. - P. 463-469.
9. Kimura H. Hydrogen sulfide: its production, release and functions //Amino acids. - 2011. - T. 41. - №. 1. - C. 113-121.
10. Lindenkamp N., Schurmann M., Steinbuchel A. A propionate CoA- transferase of Ralstonia eutropha H16 with broad substrate specificity catalyzing the CoA thioester formation of various carboxylic acids //Applied microbiology and biotechnology. - 2013. - T. 97. - №. 17. - C. 7699-7709.
11. Steinbuchel A., Lutke-Eversloh T. Metabolic engineering and pathway construction for biotechnological production of relevant polyhydroxyalkanoates in microorganisms //Biochemical Engineering Journal. - 2003. - T. 16. - №. 2. - C. 81¬96.
12. Chou Y. J. et al. Schlegelella aquatica sp. nov., a novel thermophilic bacterium isolated from a hot spring //International journal of systematic and evolutionary microbiology. - 2006. - T. 56. - №. 12. - C. 2793-2797.
13. Elbanna K. et al. Studies on the biodegradability of polythioester copolymers and homopolymers by polyhydroxyalkanoate (PHA)-degrading bacteria and PHA depolymerases //Archives of microbiology. - 2004. - T. 182. - №. 2-3. - C. 212-225.
14. Пономарева, B.T. Использование пластмассовых отходов за рубежом / В.Т. Пономарева, Н.Н. Лихачева, З.А. Ткачик // Пластические массы, 2002. - № 5. - 44-48 с.
15. Вторичные ресурсы: проблемы, перспективы, технология, экономика: Учеб. пособие / Г.К. Лобачев, В.Ф. Желтобрюхов и др. - Волгоград, 1999. - 180 с.
16. Вторичное использование полимерных материалов / Под ред. Е.Г. Любешкиной. - М., 1985. - 192 с.
17. Одесс, В.П. Вторичные ресурсы: хозяйственный механизм использования / В.П. Одесс. - М., 1988. - 15 с.
18. Васнев, В.А. Биоразлагаемые полимеры. Высокомолекулярные соединения. Сер. Б. - М., 1997.- Т. 39.- № 12.- 2073-2086 с.
19. Утилизация и вторичная переработка полимерных материалов: Учеб. пособие / А.С. Клинков, П.С. Беляев, М.В. Соколов. - Тамбов: ТГТУ, 2005. - 80 с.
20. Khanna, S. Recent advances in microbial polyhydroxyalkanoates / S. Khanna, K. Ashok // Process Biochemistry, 2004. - V. 40. - P. 607-619.
21. Lutke-Eversloh T. et al. Biosynthesis of novel thermoplastic polythioesters by engineered Escherichia coli //Nature materials. - 2002. - T. 1. - №.
4. - C. 236-240.
22. Lutke-Eversloh T. et al. Identification of a new class of biopolymer: bacterial synthesis of a sulfur-containing polymer with thioester linkages //Microbiology. - 2001. - T. 147. - №. 1. - C. 11-19.
23. Qi Q., Rehm B. H. A., Steinbuchel A. Synthesis of poly (3- hydroxyalkanoates) in Escherichia coli expressing the PHA synthase gene phaC2 from Pseudomonas aeruginosa: comparison of PhaC1 and PhaC2 //FEMS microbiology letters. - 1997. - T. 157. - №. 1. - C. 155-162.
24. Lutke-Eversloh T. et al. Biosynthesis of poly (3-hydroxybutyrate-co-3- mercaptobutyrate) as a sulfur analogue to poly (3-hydroxybutyrate)(PHB) //Biomacromolecules. - 2001. - T. 2. - №. 3. - C. 1061-1065.
25. Volova, T.G. Microbial polyhydroxyalkanoates - plastic materials of the 21st century (biosynthesis, properties, applications) / T.G. Volova // Nova Science Pub. Inc., 2004. - P.283.
26. Волова, Т.Г. Полиоксиалканоаты (ПОА) - биоразрушаемые полимеры для медицины / Т.Г. Волова, В.И. Севастьянов, Е.И. Шишацкая. - Новосибирск.: СО РАН, 2003. - 330 c.
27. Волова, Т.Г. Полиоксиалканоаты - биоразрушаемые полимеры для медицины / Т.Г. Волова, В.И. Севастьянов, Е.И. Шишацкая; под ред. В.И. Шумакова. - Красноярск: Платина, 2006. - 287 с.
28. Fernandez-Urrusuno, R. Development of controlled release formulations of alachlor in ethylcellulose / R. Fernandez-Urrusuno, J. M. Gines, E. Morillo // Journal of Microencapsulation - 2000. - V.17. - P.331-342.
29. Komives, C. Degradation of pesticides in a continuous-flow two phase microemulsion reactor / C. Komives, D. Osborn, A.J. Russel // Biotechnol Prog., 1994. - V.10(3). - P.340-343.
30. Sudesh, K. Synthesis, structure and properties of polyhydroxyalkanoates: biological polyesters / K. Sudesh, H. Abe, Y. Doi // Prog. Polym. Sci., 2000. - V. 25. - P. 1503-1555.
31. Green, Ph.R. Formation of short chain|medium chain lehgth polyhydroxyalkanoate cjpolymers by fatty acid в-oxidation inhibited Ralstonia eutropha / Ph.R. Grenn, J. Kemper, L. Schechtman, L. Guo, M. Satkowski, S. Fiedler, A. Steinbuchel, H.A. Rehm // Biomacromol., 2002. - V. 3. - P. 208-213.
32. Witholt, B., Kessler, B. Perspectives of medium chain length poly(hydroxyalkanoates), a versatile set of bacterial bioplastics // Curr. Opin. Biotechnol., 1999. - V. 10. - P. 279-285.
33. Hazer, B., Steinbuchel, A. Increased diversification of polyhydroxyalkanoates by modification reactions for industrial and medical applications // Appl. Microbiol. Biotechnol., 2007. - V. 74. - P. 1-12.
34. Tao, H.J., Macknight, W.J., Gagnon, K.D., Lenz, R.W., Hsu, S.L. Spectroscopic analysis of chain conformation distribution in a biodegradable polyester elastomer, poly(beta-hydroxyoctanoate) // Macromolecules, 1995. - V. - 28. - P. 2016-2022.
35. Liu, W.K., Chen, G.Q. Production and characterization of medium¬chain-length polyhydroxyalkanoate with high 3-hydroxytetradecanoate monomer content by fadB and fadA knockout mutant of Pseudomonas putida KT2442 // Appl. Microbiol. Biotechnol., 2007. - V. 76. - P. 1153-1159.
36. Kessler, B., Witholt, B. Factors involved in the regulatory network of polyhydroxyalkanoate metabolism // Biotechnol., 2001. - V. 86. - P. 97-104.
37. Timm, A., Steinbuchel, A. Formation of polyesters consisting of medium-chain-length 3-hydroxyalkanoic acids from gluconate by Pseudomonas aeruginosa and other fluorescent pseudomonads // Appl. Environ. Microbiol., 1990. - V. 56. - P. 3360-3367.
38. Langenbach, S. Functional expression of the PHA synthase gene phaC1 from Pseudomonas aeruginosa in Escherichia coli results in poly(3- hydroxyalkanoate) synthesis / S. Langenbach, B.H. Rehm, A. Steinbuchel // FEMS Microbiol. Lett., 1997. - V. 150. - P. 303-309.
39. Ren, Q. Fab, G. An NADPH-dependent 3-ketoacyl reductase of Pseudomonas aeruginosa, provides precursors for medium-chain-length poly-3- hydroxyalkanoate biosynthesis in Escherichia coli / Q. Ren, N. Sierro, B. Witholt, B. Kessler // Bacteriol., 2000. - V. 182. - P. 2978-2981.
40. Park, S.J. Metabolic engineering of Escherichia coli for the production of medium-chain-length polyhydroxyalkanoates rich in specific monomers / S.J. Park, J.P. Park, S.Y. Lee // FEMS Microbiol. Lett., 2002. - V. 214. - P. 217-222.
41. Diniz, S.C., Taciro, M.K., Gomez, J.G.C., Pradella, J.G.D. High-cell- density cultivation of Pseudomonas putida IPT 046 and medium-chain-length polyhydroxyalkanoate production from sugarcane carbohydrates // Appl. Biochem. Biotechnol., 2004. - V. 119. - P. 51-69.
42. Hartmann, R., Hany, R., Pletscher, E., Ritter, A., Witholt, B., Zinn, M. Tailor-made olefinic medium-chain-length poly[(R)-3-hydroxyalkanoates] by Pseudomonas putida GPo1: Batch versus chemostat production // Biotechnol. Bioeng., 2006. - V. 93. - P. 737-746.
43. Huijberts, G.N.M., Eggink, G. Production of poly(3- hydroxyalkanoates) by Pseudomonas putida KT2442 in continuous cultures // Appl. Microbiol. Biotechnol., 1996. - V. 46. -P. 233-239.
44. Kim, D.Y., Kim, H.W., Chung, M.G., Rhee, Y.H. Biosynthesis, modification, and biodegradation of bacterial medium-chain-length polyhydroxyalkanoates // J. Microbiol., 2007. - V. 45. - P. 87-97.
45. van Beilen, J.B., Panke, S., Lucchini, S., Franchini, A.G., Rothlisberger, M., Witholt, B. Analysis of Pseudomonas putida alkane¬degradation gene clusters and flanking insertion sequences: evolution and regulation of the alk genes // Microbiol., 2001. - V. 147. - P. 1621-1630.
46. Jung, K., Hazenberg, W., Prieto, M., Witholt, B. Two-stage continuous process development for the production of medium-chain-length poly(3- hydroxyalkanoates) // Biotechnol. Bioeng., 2001. - V. 72. - P. 19-24.
47. Kim, B.S. Production of poly(3-hydroxybutyric-co-3-hydroxyvaleric acid) by fed-batch culture of Alcaligenes eutrophus with substrate control using on¬line glucose analyzer / B.S. Kim, S.C. Lee, S.Y. Lee, H.N. Chang, Y.K. Chang, S.I. Woo // Enzyme. Microb. Technol., 1994. - V. 16. - P. 556-561.
48. Lageveen, R.G., Huisman, G.W., Preusting, H., Ketelaar, P., Eggink, G., Witholt, B. Formation of polyesters by Pseudomonas oleovorans: effect of substrates on formation and composition of poly-(R)-3-hydroxyalkanoates and poly-(R)-3-hydroxyalkenoates // Appl. Environ. Microbiol., 1988. - V. 54. - P. 2924-2932.
49. Elbahloul, Y., Steinbuchel, A. Large-scale production of poly(3- hydroxyoctanoic acid) by Pseudomonas putida GPo1 and a simplified downstream process // Appl. Environ. Microbiol., 2009. - V. 75. - P. 643-651.
50. Шлегель, Г.Общая микробиология / Г. Шлегель // Мир. - М., 1987.- C. 567.
51. Лакин, Г.Ф. Биометрия / Учеб. пособие для университетов и педагогических институтов // Высшая школа. - М., 1973. - C. 343.