ВЕДЕНИЕ 4
1 Обзор литературы 6
1.1 Характеристика ПГ А 6
1.2 Синтез ПГА 8
1.3 Потенциальные источники углерода для синтеза ПГА іо
1.3.1 Глицерин в биосинтезе ПГА 11
2 Материалы и методы 16
2.1 Объект исследования 16
2.2 Культивирование ПГА 16
2.3 Культивирование ПГА с использованием глицерина в качестве субстрата 18
2.3.1 Определение концентрации глицерина 18
2.4 Микробиологический контроль 21
2.5 Экстракция полимера 22
2.6 Анализ физико-химических свойств сополимеров ПГА 23
2.6.1 Определение содержания и состава полимера 23
2.6.2 Определение молекулярной массы и молекулярно массовое
распределение полимера 24
2.6.3 Дифференциальная сканирующая калориметрия (ДСК) 25
2.7 Методы обработки данных 26
ВЫВОДЫ 38
Список литературы 40
На сегодняшний день остаются актуальными вопросы создания экологически безопасных материалов, удовлетворяющих современным потребностям. Это связано с высокой устойчивостью к биодеградации изделий из пластика, полученных из нефти. С конца 60-х годов активно ведутся работы по исследованию биополимеров (биопластиков). Существуют два основных вида биополимеров: полимеры, производимые при помощи биологических систем (таких как микроорганизмы) и химически синтезированные полимеры на основе биологического сырья (аминокислот, сахаров, жиров) [1].
Полигидроксиалканоаты (ПГА) представляют семейство полиэстеров, синтезируемых прокариотическими организмами в условиях несбалансированного роста, которые используют для этого различные субстраты (сахара, органические кислоты, спирты и др.). В настоящее время ведутся активные исследования ПГА. Сферы применения ПГА потенциально широки и могут включать сельское и коммунальное хозяйство, радиоэлектронику, фармакологию, медицину [2]. Микробные ПГА способны разрушаться в различных средах, это одно из наиболее привлекательных коммерческих свойств. Кроме того, гомогенный полигидроксибутират, как наиболее популярный представитель ПГА, по механическим свойствам сходен с полипропиленом и полистером, однако обладает лучшими газобарьерными свойствами (например, по отношению к кислороду) и большей устойчивостью к ультрафиолету, характеризуется также хорошей водостойкостью и теплоустойчивостью, при этом проницаемость водяного пара через него втрое ниже по сравнению с полипропиленом [3].
С 80-х годов ПГА становятся предметом активных исследований, особенно в Западной Европе, США, Японии. Наиболее популярными компаниями, занимающимися производством ПГА являются «Монсанто К°», «Metabolix Inc.», «Tepha», «Procter & Gambel» и др. [4]. Однако их коммерческое использование ограниченно их высокой себестоимостью
Благодаря своей низкой цене относительно других субстратов, глицерин является перспективным источником для микробного производства ПГА. В связи с увеличением производства глицерина из-за растущего производства биодизеля, цены на глицерин стали достаточно низкими, чтобы использовать это остаточное соединение в качестве «дешевого источника углерода» для биосинтеза микробных полиэфиров [5].
Цель данной работы - Исследовать ростовые характеристики бактерий Cupriavidus eutrophus B106-46 в процессе биосинтеза ПГА с использованием глицерина в качестве альтернативного углеродного субстрата.
Задачи:
1. Адаптировать бактерии Cupriavidus eutrophus B106-46 к глицериновому субстрату
2. Исследовать кинетические и продукционные показатели культуры в режиме синтеза полигидроксиалканоатов(ПГА)
3. Дать оценку физико-химическим свойствам полученных образцов ПГА
1. Процесс адаптации штамма к неспецифичному субстрату формируются длительно в результате многократного и продолжительного пересева культуры. в результате проделанной работы, удалось уменьшить длительность лат-фазы до 2 ч, что связано с адаптацией бактерий к субстрату, максимальная удельная скорость роста составила до 0,06ч-1 в первые часы культивирования.
2. Исследованы кинетические и продукционные показатели процесса биосинтеза П3ГБ в ходе которого установлено, диапазон оптимальных концентраций глицерина лежит в пределах от 5 до 14 г/л, значение субстратной константы Ks = 0,86г/л. Максимальная удельная скорость роста микроорганизмов (0,06 ч-1) зафиксирована при концентрации глицерина 8 г/л. Y для глицерина равен 0,37, что сравнимо с экономическими коэффициентами при использовании других субстратов таких как фруктоза и глюкоза. Максимальное производство биомассы составило 8,7 г/л после 96 ч ферментации, на долю которой приходилось накопление 67% П3ГБ. Удельная скорость синтеза полимера в процессе культивирования в среднем 0,02 ч-1, максимальная удельная скорость синтеза ПГА зафиксирована после 12 часов культивирования и составила - 0,05 ч-1.
3. Хроматографический анализ полученных образцов установил, что ПГА представлен мономером 3-гидроксибутирата. Изучены физико¬химические свойства образцов ПГА синтезированных на глицериновом субстрате. Выяснилось, что значение Mw незначительно ниже по сравнению со значениями, полученными в разных литературных источниках при синтезе полимера с использованием глюкозных и фруктозных субстратов. Исследованы термические свойства полученных образцов П3ГБ из глицерина оценены с использованием Дифференциальносканирующей каллориметрии(ДСК). В результате анализа Тил = 174, Тдегр=293, Ткрист=106. Полученные температурные характеристики ПГА сравнимы с результатами при культивировании Cupriavidus eutrophus B10646 на глюкозе и фруктозе. Образцы с полученными свойствами материала и характеристиками, подходят для многих исследований.
В результате проделанной работы установлено, что глицерин может использоваться как источник углерода для производства ПГА. Ростовые характеристики процесса практически не уступают культивированию бактерий при использовании таких известных субстратов как глюкоза и фруктоза. Тем не менее, масштабирование производства, требует дальнейшего изучения.
