Перечень условных обозначений 4
Введение 5
1 Обзор литературы 7
1.1 Общие сведения о раке кишечника 7
1.2 Эпигенетические изменения 9
1.3 Метилирование ДНК 11
1.4 Внеклеточные ДНК 16
1.5 Метилирование внеклеточных ДНК при РК 18
2 Материалы и методы исследования 22
2.1 Материалы 22
2.2 Методы исследования 23
2.2.1 Взятие образцов крови 23
2.2.2 Приготовление элюатов с поверхности форменных элементов
крови 24
2.2.3 Выделение циркулирующих ДНК из плазмы и элюатов с
клеточной поверхности 24
2.2.4 Бисульфитная обработка ДНК 26
2.2.5 Метил-специфичная полимеразная цепная реакция 28
2.2.5.1 SEPT9 28
2.2.5.2 IKZF1 28
2.2.5.3 MGMT 29
2.2.5.4 LINE-1 30
2.3 Статистическая обработка данных 31
3 Результаты 33
4 Обсуждение 40
Выводы 44
Заключение 45
Список использованной литературы 47
Приложение А 56
ПЕРЕЧЕНЬ
Рак кишечника (РК) занимает третье место по заболеваемости (10%) и второе место по смертности (9,4%) среди онкозаболеваний. Во всем мире за 2020 год было диагностировано 1,9 млн. случаев рака толстой и прямой кишки и 935 тыс. случаев смерти от онкологических заболеваний данной локализации [1, 2]. К 2040 году, по прогнозам ВОЗ, количество случаев рака кишечника возрастет до 3,2 млн., а количество смертей - до 1,6 млн [3]. Несмотря на существующие достижения в раннем выявлении и лечении, ведущие к снижению заболеваемости и смертности, у 30-50% пациентов развиваются рецидивы или метастазы в течение пяти лет лечения [4]. Таким образом, в дополнение к существующим клиническим и патологическим факторам, определяющим прогноз заболевания и выживаемость пациентов, необходимы новые молекулярные маркеры для улучшения персонализированной терапии больных раком прямой кишки и для мониторинга рецидивов.
Известно, что во время инициации и прогрессирования онкогенеза нарушаются нормальные эпигенетические процессы, включая глобальные изменения нормальных паттернов метилирования ДНК [24].
Многочисленные исследования описывают репрессию генов-супрессоров опухолей во время канцерогенеза за счет гиперметилирования ДНК их промоторов. При этом глобальное гипометилирование генома раковых клеток приводит к геномной нестабильности, повторной экспрессии молчащих генов и усилению анеуплоидии [27-29].
Результаты экспериментальных работ показали, что ретротранспозоны LINE-1 приобретают онкогенный потенциал в результате их гипометилирования, а гены SEPT9, IKZF1и MGMTв результате их гиперметилирования, что указывает на их значимость в качестве потенциальных диагностических и прогностических маркеров [27, 29, 38-40, 44, 45, 67-69].
На сегодняшний день отсутствуют данные относительно характера изменения уровня метилирования ретротранспозонов, генов опухолевой супрессии в цирДНК в ответ на противоопухолевое лечение. В связи с этим перспективным является исследование характера изменений уровня метилирования генов опухолевой супрессии и ретротранспозонов в составе цирДНК крови в ответ на терапию при раке прямой кишки.
Цель работы: проведение анализа уровня метилирования последовательностей в составе циркулирующих ДНК у больных раком прямой кишки до и после терапии.
Задачи:
1. Формирование банка циркулирующих ДНК из фракций крови от больных раком прямой кишки (безметастатический и метастатический рак).
2. Выбор аберрантно метилированных генов на основе анализа научной литературы, содержащей сведения об изменении их метилирования в крови больных раком прямой кишки.
3. Отработка протоколов определения уровня метилирования аберрантно метилированных генов в составе циркулирующих ДНК крови больных РК.
4. Исследование изменения уровня метилирования последовательностей в составе циркулирующих ДНК до лечения и в процессе противоопухолевой терапии у больных раком прямой кишки.
В данной работе был проведен анализ уровня метилирования LINE-1 в скп-цир ДНК у больных РК на этапах динамического наблюдения (после неоадъювантной химиотерапии и последующего хирургического вмешательства). Также был проведен сравнительный анализ статуса метилирования генов SEPT9, IKZF1и MGMTв цирДНК у больных раком прямой кишки.
Показана значимость увеличения индекса метилирования LINE-1 элементов в скп-цирДНК крови для мониторинга состояния больных раком кишечника после проведенного комбинированного лечения.
Уровень изменений индекса метилирования LINE-1в цирДНК и скп- цирДНК оказались различны: фракция скп-цир ДНК характеризовалась более выраженным снижением ИМ, чем цирДНК плазмы, что подтверждает большую информативность данного маркера.
Выявлена зависимость динамики изменения индекса метилирования (ИМ) от противоопухолевого лечения: после химиотерапии наблюдалось значительное увеличение индекса метилирования, примерно в 2 раза, а после операции - значительное увеличение индекса метилирования в 3 раза. Полученные результаты говорят о перспективности исследования на расширенных выборках больных РК значимости индекса метилирования LINE-1в цирДНК крови для прогноза ответа опухоли на лечение, оценки эффективности терапии и раннего выявления рецидивов.
Было выявлено, что уровень метилирование SEPT9и IKZFlv,скп- цирДНК изменяется в крови у больных раком прямой кишки в процессе лечения у 36% и у 50% пациентов, соответственно. После противоопухолевой терапии концентрация метилированных маркеров в крови снижалась. Данные показатели говорят об перспективности применения данных маркеров для оценки эффективности терапии. В свою очередь ген MGMTне показал какой-либо клинической значимости.
