Тема:
Поиск генов ферментов, участвующих в биодеградации фракций нефти (аренов и алканов) и органических загрязнителей (нитрофенол, полихлорбифенил) в штаммах консорциума микроорганизмов «Абориген»
Представленный материал является образцом учебного исследования, примером структуры и содержания учебного исследования по заявленной теме. Размещён исключительно в информационных и ознакомительных целях.
Workspay.ru оказывает информационные услуги по сбору, обработке и структурированию материалов в соответствии с требованиями заказчика.
Размещение материала не означает публикацию произведения впервые и не предполагает передачу исключительных авторских прав третьим лицам.
Материал не предназначен для дословной сдачи в образовательные организации и требует самостоятельной переработки с соблюдением законодательства Российской Федерации об авторском праве и принципов академической добросовестности.
Авторские права на исходные материалы принадлежат их законным правообладателям. В случае возникновения вопросов, связанных с размещённым материалом, просим направить обращение через форму обратной связи.
ℹ️Настоящий учебно-методический информационный материал размещён в ознакомительных и исследовательских целях и представляет собой пример учебного исследования. Не является готовым научным трудом и требует самостоятельной переработки.
ВВЕДЕНИЕ 5
1 Обзор литературы 7
1.1 Источники загрязнений почв и водоёмов 7
1.1.1 Нефть: основные фракции и их состав 7
1.1.2 Нефть как органический загрязнитель 8
1.1.3 Органические загрязнители почв и водоемов, сопутствующие
деятельности человека 9
1.2 Использование потенциала микроорганизмов для очистки почв и водоёмов ....
10
1.2.1 Деградация алканов микроорганизмами 12
1.2.2 Деградация нафтенов микроорганизмами 15
1.2.3 Деградация аренов микроорганизмами 17
1.2.4 Деградация ПАУ микроорганизмами 23
1.2.5 Деградация фенантрена и антрацена микроорганизмами 26
1.2.6 Деградация бензпирена микроорганизмами 27
1.3 Гены ферментов, участвующих в деградации различных соединений нефти ....
28
1.3.1 Гены ферментов, участвующих в деградации алканов 29
1.3.2 Гены ферментов, участвующих в деградации моноароматических
соединений 32
1.3.3 Гены ферментов, участвующих в деградации ПАУ 35
1.4 Применение штаммов микроорганизмов для ремедиации почвы 37
2 Материалы и методы 39
2.1 Получение образцов плазмидной ДНК 39
2.2 Получение образцов хромосомной ДНК 39
2.3 Выделение образцов хромосомной ДНК из геля 39
2.4 ПЦР-анализ штаммов на наличие генов биодеградации углеводородов
нефти 40
2.5 Электрофорез образцов ДНК 40
3 Результаты и их обсуждение 41
3.1 Получение чистых фракций штаммов 41
3.2 Поиск ферментов для анализа деградации фракций нефти 42
3.3 Поиск генов ферментов, участвующих в деградации органических
загрязнителей в штаммах консорциума «Абориген» 46
ВЫВОДЫ 52
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 53
📖 Введение
Экологический ущерб от загрязнения почв углеводородами весьма велик - от снижения качества и продуктивности почв до вывода земель из сельскохозяйственного оборота. Создаётся опасность загрязнения подземных и поверхностных вод в результате попадания нефтепродуктов в водоносные горизонты, реки и водоёмы. Нефть и продукты ее переработки, многие из которых чрезвычайно токсичны, канцерогенны и персистентны, то есть разрушаются крайне медленно, в частности, в Сибири с ее холодным климатом. Известно, что биодеградация нефти и нефтепродуктов в почве происходит при активном участии почвенных микроорганизмов, способных использовать соединения нефти в качестве источника энергии. Тем не менее, когда концентрация загрязнителя в почве относительно высока, как происходит при разливах, естественной микрофлоре необходимо время для адаптации к ксенобиотику. Ауторемедиация нефтезагрязненных почв может длиться до 30 лет, в северных регионах период декструкции составляет 50 и более лет, а токсические свойства нефти исчезают через 10-12 лет после рекультивационных работ [Неустроев, 2015]. Чтобы ускорить время биоремедиации и/или улучшить её качество, т.е. достигнуть более низких значений остаточной концентрации загрязнителя применяют различные методы биоремедиации, в том числе микробные препараты содержащие как отдельные штаммы нефтедеструкторов, так и целые консорциумы, выделенные из естественной среды. Одним из таких препаратов является «Абориген» производства «ООО Дарвин» содержащий штаммы микроорганизмов, выделенных из природных естественных ландшафтов с застарелыми разливами на нефтяных месторождениях Ханты-Мансийского и Ямало-Ненецкого автономного округа. На базе Национального Исследовательского Томского Государственного университета и научно-производственной лаборатории компании Дарвин проведены лабораторные исследования, подтвердившие высокую эффективность биопрепарата. Однако пока неизвестно какие именно ферменты и кодирующие их гены ответственны за эту способность в штаммах консорциума «Абориген». Выделение генов, ассоциированы^ с деградацией различных соединений нефти и других органических загрязнителей может помочь в улучшении состава микробного препарата путем получения одного или двух многофункциональных генноинженерных штаммов с множественной активностью.
Целью данной магистерской диссертации является поиск генов ферментов, участвующих в биодеградации фракций нефти (аренов и алканов) и органических загрязнителей (нитрофенол, полихлорбифенил) в штаммах консорциума микроорганизмов «Абориген».
Для выполнения поставленной цели были выделены следующие задачи:
1. Наработка клеточной массы штаммов Pseudomonas sp. 2Н, Bacillus subtiles B10, Acinetobacter calcoaceticus B1318 консорциума «Абориген», ответственных за биодеградацию нефти для получения чистой хромосомной и плазмидной ДНК.
2. Выделение чистой хромосомной и плазмидной ДНК из штаммов конорциума «Абориген».
3. На основе литературных данных подбор оптимальных праймеров для поиска генов ферментов, участвующих в деградации аренов и алканов, а также органических загрязнителей.
4. Анализ наличия нуклеотидной последовательности ферментов участвующих в деградации аренов и алканов CatA, NahH, AlkBв хромосомной и плазмидной ДНК, выделенных из штаммов консорциума «Абориген» Pseudomonas sp. 2Н, Bacillus subtiles B10, Acinetobacter calcoaceticus B1318.
5. Анализ наличия нуклеотидной последовательности ферментов участвующих в биодеградации органических загрязнителей NpcB, BphA4в хромосомной и плазмидной ДНК, из штаммов консорциума «Абориген» Pseudomonas sp. 2Н, Bacillus subtiles B10, Acinetobacter calcoaceticus B1318.
✅ Заключение
1. В результате культивирования штаммов биодеградации углеводородов на селективной среде и последующих методов выделения ДНК и очистки с помощью гель- электрофореза получены чистые фракции хромосомной и плазмидной ДНК штаммов Pseudomonas sp. 2Н, Bacillus subtiles B10, Acinetobacter calcoaceticus B1318 консорциума «Абориген».
2. Методом ПЦР выявлены гены ферментов, участвующих в деградации нефти (аренов и алканов) у штаммов 2Н, B10, B1318 консорциума «Абориген». Ген деградации алифатических углеводородов (AlkB)обнаружен в хромосомной ДНК всех исследуемых штаммов. В плазмидной ДНК штаммов B10, 2H и В1318 AlkBне выявлен. Ген деградации ароматических соединений по орто-механизму расщепления кольца (катехол-1,2- диоксигеназа) обнаружен как в плазмидной, так и в хромосомной ДНК всех трёх штаммов. Ген деградации ароматических соединений по мета-механизму расщепления кольца (катехол-2,3-диоксигеназа) обнаружен в штаммах В1318 и В10, только в хромосомной ДНК.
3. Выявлены гены ферментов, участвующих в деградации органических загрязнителей в штаммах 2Н, B10, B1318 консорциума «Абориген» . Во всех исследуемых штаммах обнаружен ген окисления п-нитрофенола. Ген бифенил-2,3-диоксигеназы (BphA4)по результатам ПЦР найден в хромосомной ДНК штаммов B10 и 2H и плазмидной ДНК штаммов B1318 и В10.