📄Работа №196419
Тема: СОЗДАНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННОЙ КЛЕТОЧНОЙ ЛИНИИ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ РОЛИ ГЕНА МУС В МЕТАСТАЗИРОВАНИИ
Тип работы
Магистерская диссертация
Предмет
биология
Объем:
68 листов
Год:
2023
Просмотров:
34
4865
руб.
🛒 Купить работу
Не подходит эта работа?
Закажите новую по вашим требованиям
Узнать цену на написание
Закажите новую по вашим требованиям
Представленный материал является образцом учебного исследования, примером структуры и содержания учебного исследования по заявленной теме. Размещён исключительно в информационных и ознакомительных целях.
Workspay.ru оказывает информационные услуги по сбору, обработке и структурированию материалов в соответствии с требованиями заказчика.
Размещение материала не означает публикацию произведения впервые и не предполагает передачу исключительных авторских прав третьим лицам.
Материал не предназначен для дословной сдачи в образовательные организации и требует самостоятельной переработки с соблюдением законодательства Российской Федерации об авторском праве и принципов академической добросовестности.
Авторские права на исходные материалы принадлежат их законным правообладателям. В случае возникновения вопросов, связанных с размещённым материалом, просим направить обращение через форму обратной связи.
Настоящий учебно-методический информационный материал размещён в ознакомительных и исследовательских целях и представляет собой пример учебного исследования. Не является готовым научным трудом и требует самостоятельной переработки.
📋 Содержание
ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ 4
ВВЕДЕНИЕ 5
1 Обзор литературы 7
1.1 Модели гетерогенности опухоли 7
1.2 Раковые стволовые клетки: характеристика и онкогенез 9
1.3 Клеточная пластичность 14
1.4 Механизмы клеточной пластичности 17
1.5 Роль гена MYCв онкогенезе 23
1.6 Ингибирование экспрессии MYC 27
2 Материалы и методы 34
2.1 Дизайн последовательностей gRNA 34
2.2 Клонирование последовательностей, кодирующих gRNA, в плазмидный
вектор pX458D10A методом Golden Gate 36
2.2.1 Отжиг и фосфорилирование олигонуклеотидов 36
2.2.2 Клонирование олигодуплексов в плазмидный вектор pX458D10A
методом Golden Gate 37
2.3 Трансформация компетентных клеток Escherichia coli Stable3 лигазной
смесью 37
2.4 Выделение плазмидной ДНК из культуры клеток E. coli 38
2.5 Скрининг рекомбинантных плазмид pX458D10A 40
2.6 Культивирование клеток линии MDA-MB231 40
2.7 Трансфекция клеток линии MDA-MB231 рекомбинантными
плазмидами pX458D10A 41
2.8 Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток 43
2.9 Анализ образования маммосфер 45
3 Результаты и обсуждение 46
3.1 Дизайн последовательностей gRNA 46
3.2 Скриниг рекомбинантных плазмид pX458D10A 47
3.3 Трансфекция клеток линии MDA-MB231 рекомбинантными
плазмидами pX458D10A 50
3.4 Оценка экспрессии генаMYCв клеточных линиях MDA-MB231
методом иммунофлуоресцентного окрашивания антителами 52
3.5 Анализ образования маммосфер 54
ВЫВОДЫ 60
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 61
ВВЕДЕНИЕ 5
1 Обзор литературы 7
1.1 Модели гетерогенности опухоли 7
1.2 Раковые стволовые клетки: характеристика и онкогенез 9
1.3 Клеточная пластичность 14
1.4 Механизмы клеточной пластичности 17
1.5 Роль гена MYCв онкогенезе 23
1.6 Ингибирование экспрессии MYC 27
2 Материалы и методы 34
2.1 Дизайн последовательностей gRNA 34
2.2 Клонирование последовательностей, кодирующих gRNA, в плазмидный
вектор pX458D10A методом Golden Gate 36
2.2.1 Отжиг и фосфорилирование олигонуклеотидов 36
2.2.2 Клонирование олигодуплексов в плазмидный вектор pX458D10A
методом Golden Gate 37
2.3 Трансформация компетентных клеток Escherichia coli Stable3 лигазной
смесью 37
2.4 Выделение плазмидной ДНК из культуры клеток E. coli 38
2.5 Скрининг рекомбинантных плазмид pX458D10A 40
2.6 Культивирование клеток линии MDA-MB231 40
2.7 Трансфекция клеток линии MDA-MB231 рекомбинантными
плазмидами pX458D10A 41
2.8 Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток 43
2.9 Анализ образования маммосфер 45
3 Результаты и обсуждение 46
3.1 Дизайн последовательностей gRNA 46
3.2 Скриниг рекомбинантных плазмид pX458D10A 47
3.3 Трансфекция клеток линии MDA-MB231 рекомбинантными
плазмидами pX458D10A 50
3.4 Оценка экспрессии генаMYCв клеточных линиях MDA-MB231
методом иммунофлуоресцентного окрашивания антителами 52
3.5 Анализ образования маммосфер 54
ВЫВОДЫ 60
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 61
📖 Введение
Рак молочной железы (РМЖ) в настоящее время является самым частым онкологическим заболеванием у женщин. Ежегодно в мире выявляется более 1,7 миллиона случаев данного заболевания [Woolston et al., 2015]. Выяснение механизмов метастазирования при РМЖ является одной из основных задач современной онкологии, поскольку около 40 % случаев заболевания сопровождается возникновением рецидивов, а 60-70 % этих рецидивов приходится на отдаленные метастазы [Дашян и др., 2015]. Подавляющее большинство смертей (около 90 %), связанных с раком, вызвано метастазами, а не первичными опухолями, при этом этот процесс остается наименее изученным аспектом биологии рака [Lambert et al., 2017].
Согласно иерархической модели роста опухоли только раковые стволовые клетки (РСК), а не дифференцированные опухолевые клетки, являются клетками, поддерживающими рост опухоли и способными давать начало росту вторичных опухолевых узлов [Dick et al., 2008].
Следовательно, РСК вызывают большой интерес в качестве мишеней, на которые может быть направлена таргетная терапия с целью остановки развития и метастазирования опухоли [Дашян и др., 2015]. Однако такая терапевтическая стратегия, во время которой происходит нацеливание исключительно на РСК, недостаточна для сдерживания прогрессирования рака, поскольку существует такое явление, как стволовая пластичность [Thankamony et al., 2021]. Под этим термином понимают способность дифференцированных клеток дедифференцироваться в стволовые [Gupta et al., 2011; Chaffer et al., 2013]. Для эффективной противоопухолевой терапии необходимо выявить факторы, способствующие данному явлению . Предполагают, что на стволовую пластичность и, следовательно, на метастазирование оказывает роль амплификация регионов, содержащих гены стволовости, в частности ген MYC [Litviakov et.al., 2020b].
Таким образом, целью данного исследования является получение генетически модифицированной линии клеток РМЖ MDA-MB231 для исследования роли гена MYCв метастазировании.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
1. Выполнить дизайн gRNA и получить рекомбинантные векторные плазмиды для нокаута гена MYCметодом CRISPR/Cas9.
2. Провести трансфекцию клеточной линии аденокарциномы молочной железы человека MDA-MB231 рекомбинантными плазмидами для получения генетически-модифицированной линии клеток.
3. Оценить эффективность нокаута гена MYCв клетках MDA- MB231 после генетической модификации методом иммунофлуоресцентного окрашивания.
4. Сравнить способность клеток исходной и генетически модифицированной клеточных линий MDA-MB231 к образованию маммосфер.
Согласно иерархической модели роста опухоли только раковые стволовые клетки (РСК), а не дифференцированные опухолевые клетки, являются клетками, поддерживающими рост опухоли и способными давать начало росту вторичных опухолевых узлов [Dick et al., 2008].
Следовательно, РСК вызывают большой интерес в качестве мишеней, на которые может быть направлена таргетная терапия с целью остановки развития и метастазирования опухоли [Дашян и др., 2015]. Однако такая терапевтическая стратегия, во время которой происходит нацеливание исключительно на РСК, недостаточна для сдерживания прогрессирования рака, поскольку существует такое явление, как стволовая пластичность [Thankamony et al., 2021]. Под этим термином понимают способность дифференцированных клеток дедифференцироваться в стволовые [Gupta et al., 2011; Chaffer et al., 2013]. Для эффективной противоопухолевой терапии необходимо выявить факторы, способствующие данному явлению . Предполагают, что на стволовую пластичность и, следовательно, на метастазирование оказывает роль амплификация регионов, содержащих гены стволовости, в частности ген MYC [Litviakov et.al., 2020b].
Таким образом, целью данного исследования является получение генетически модифицированной линии клеток РМЖ MDA-MB231 для исследования роли гена MYCв метастазировании.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
1. Выполнить дизайн gRNA и получить рекомбинантные векторные плазмиды для нокаута гена MYCметодом CRISPR/Cas9.
2. Провести трансфекцию клеточной линии аденокарциномы молочной железы человека MDA-MB231 рекомбинантными плазмидами для получения генетически-модифицированной линии клеток.
3. Оценить эффективность нокаута гена MYCв клетках MDA- MB231 после генетической модификации методом иммунофлуоресцентного окрашивания.
4. Сравнить способность клеток исходной и генетически модифицированной клеточных линий MDA-MB231 к образованию маммосфер.
✅ Заключение
1. Выполнен дизайн трёх пар последовательностей gRNA, направляющих никазу nCas9 к экзону 2 гена MYC,и получено 6 рекомбинантных векторных плазмид, предназначенных для нокаута гена MYCв клетках человека.
2. Снижение количества белкового продукта гена MYC подтверждено методом окрашивания со специфическими антителами в клетках двух моноклональных линий MDA-MB231 clone 6 и MDA-MB231 clone 10.
3. Показано, что клетки линии MDA-MB231 clone 6 с нокаутом гена MYCобразуют маммосферы меньшего диаметра по сравнению с исходной клеточной линией MDA-MB231.
4. Получена модельная моноклональная клеточная линия аденокарциномы молочной железы человека MDA-MB231 с нокаутом гена MYC.
2. Снижение количества белкового продукта гена MYC подтверждено методом окрашивания со специфическими антителами в клетках двух моноклональных линий MDA-MB231 clone 6 и MDA-MB231 clone 10.
3. Показано, что клетки линии MDA-MB231 clone 6 с нокаутом гена MYCобразуют маммосферы меньшего диаметра по сравнению с исходной клеточной линией MDA-MB231.
4. Получена модельная моноклональная клеточная линия аденокарциномы молочной железы человека MDA-MB231 с нокаутом гена MYC.
ИЛИ
Поиск аналога
📕 Список литературы
🛒 Оформить заказ
⚡ Работу высылаем в течении 5 минут после оплаты.