Рак молочной железы (РМЖ) в настоящее время является самым частым онкологическим заболеванием у женщин. Ежегодно в мире выявляется более 1,7 миллиона случаев данного заболевания [Woolston et al., 2015]. Выяснение механизмов метастазирования при РМЖ является одной из основных задач современной онкологии, поскольку около 40 % случаев заболевания сопровождается возникновением рецидивов, а 60-70 % этих рецидивов приходится на отдаленные метастазы [Дашян и др., 2015]. Подавляющее большинство смертей (около 90 %), связанных с раком, вызвано метастазами, а не первичными опухолями, при этом этот процесс остается наименее изученным аспектом биологии рака [Lambert et al., 2017].
Согласно иерархической модели роста опухоли только раковые стволовые клетки (РСК), а не дифференцированные опухолевые клетки, являются клетками, поддерживающими рост опухоли и способными давать начало росту вторичных опухолевых узлов [Dick et al., 2008].
Следовательно, РСК вызывают большой интерес в качестве мишеней, на которые может быть направлена таргетная терапия с целью остановки развития и метастазирования опухоли [Дашян и др., 2015]. Однако такая терапевтическая стратегия, во время которой происходит нацеливание исключительно на РСК, недостаточна для сдерживания прогрессирования рака, поскольку существует такое явление, как стволовая пластичность [Thankamony et al., 2021]. Под этим термином понимают способность дифференцированных клеток дедифференцироваться в стволовые [Gupta et al., 2011; Chaffer et al., 2013]. Для эффективной противоопухолевой терапии необходимо выявить факторы, способствующие данному явлению . Предполагают, что на стволовую пластичность и, следовательно, на метастазирование оказывает роль амплификация регионов, содержащих гены стволовости, в частности ген MYC [Litviakov et.al., 2020b].
Таким образом, целью данного исследования является получение генетически модифицированной линии клеток РМЖ MDA-MB231 для исследования роли гена MYCв метастазировании.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
1. Выполнить дизайн gRNA и получить рекомбинантные векторные плазмиды для нокаута гена MYCметодом CRISPR/Cas9.
2. Провести трансфекцию клеточной линии аденокарциномы молочной железы человека MDA-MB231 рекомбинантными плазмидами для получения генетически-модифицированной линии клеток.
3. Оценить эффективность нокаута гена MYCв клетках MDA- MB231 после генетической модификации методом иммунофлуоресцентного окрашивания.
4. Сравнить способность клеток исходной и генетически модифицированной клеточных линий MDA-MB231 к образованию маммосфер.
1. Выполнен дизайн трёх пар последовательностей gRNA, направляющих никазу nCas9 к экзону 2 гена MYC,и получено 6 рекомбинантных векторных плазмид, предназначенных для нокаута гена MYCв клетках человека.
2. Снижение количества белкового продукта гена MYC подтверждено методом окрашивания со специфическими антителами в клетках двух моноклональных линий MDA-MB231 clone 6 и MDA-MB231 clone 10.
3. Показано, что клетки линии MDA-MB231 clone 6 с нокаутом гена MYCобразуют маммосферы меньшего диаметра по сравнению с исходной клеточной линией MDA-MB231.
4. Получена модельная моноклональная клеточная линия аденокарциномы молочной железы человека MDA-MB231 с нокаутом гена MYC.
