Тема:
ПОИСК НУКЛЕОТИДНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ГЕНОВ ФЕРМЕНТОВ, УЧАСТВУЮЩИХ В БИОДЕГРАДАЦИИ РАЗЛИЧНЫХ ФРАКЦИЙ НЕФТИ В ПЛАЗМИДНОЙ ДНК ШТАММОВ КОНСОРЦИУМА МИКРООРГАНИЗМОВ «АБОРИГЕН»
Представленный материал является образцом учебного исследования, примером структуры и содержания учебного исследования по заявленной теме. Размещён исключительно в информационных и ознакомительных целях.
Workspay.ru оказывает информационные услуги по сбору, обработке и структурированию материалов в соответствии с требованиями заказчика.
Размещение материала не означает публикацию произведения впервые и не предполагает передачу исключительных авторских прав третьим лицам.
Материал не предназначен для дословной сдачи в образовательные организации и требует самостоятельной переработки с соблюдением законодательства Российской Федерации об авторском праве и принципов академической добросовестности.
Авторские права на исходные материалы принадлежат их законным правообладателям. В случае возникновения вопросов, связанных с размещённым материалом, просим направить обращение через форму обратной связи.
ℹ️Настоящий учебно-методический информационный материал размещён в ознакомительных и исследовательских целях и представляет собой пример учебного исследования. Не является готовым научным трудом и требует самостоятельной переработки.
ВВЕДЕНИЕ 5
1 Обзор литературы 7
1.1 Нефть и её состав 7
1.1.1 Основные фракции нефти 7
1.1.2 Полициклические ароматические углеводороды 9
1.1.3 Нафталин 10
1.2 Нефть как органический загрязнитель окружающей среды 11
1.2.1 Загрязнения при нефтедобыче в Западной Сибири 13
1.3 Использование микроорганизмов для биоремедиации природных сообществ .... 15
1.3.1 Деградация алканов микроорганизмами 16
1.3.2 Деградация аренов микроорганизмами 19
1.3.3 Деградация ПАУ микроорганизмами 23
1.4 Консорциум «Абориген» 26
2 Материалы и методы 28
2.1 Объект исследования 28
2.2 Материал исследования 28
2.3 Культивирование штаммов, ответственных за биодеградацию углеводородов ....28
2.4 Выделение плазмидной ДНК 28
2.5 Разработка праймеров 29
2.6 Проведение ПЦР 29
2.7 Проверка ПЦР продукта методом гель-электрофорез 29
2.8 Культивирование штаммов на среде с добавлением нафталина 30
2.9 Подсчёт биомассы клеточной культуры 30
2.10 Статистический анализ данных 30
ВЫВОДЫ 46
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ И ЛИТЕРАТУРЫ 47
📖 Введение
Нефть является одним из основных загрязнителей, представляя собой природную смесь, состоящую из большого числа углеводородов разнообразного строения и высокомолекулярных смолистых и асфальтеновых веществ. На сегодняшний день в мире остро стоит проблема загрязнения окружающей среды токсичными отходами нефтеперерабатывающих предприятий. Особую опасность для природных сообществ представляют места хранения остатков, а также аварии при добыче и транспортировке нефти и нефтепродуктов. [Пиковский и др., 2003]
Полициклические ароматические углеводороды (ПАУ), представляющие собой одну из распространённых фракций нефти, являются органическими соединениями, имеющими в своей химической структуре два и более бензольных кольца. Многие ПАУ оказывают канцерогенное влияние на живые организмы. К этой группе относится и нафталин, являющийся широко распространенным в окружающей среде поллютантом.
Экосистемное значение имеют процессы самоочищения биосферы от нефти и нефтепродуктов. Эти процессы зависят от свойств самой нефти, а также от внешних условий, особенно климатических. Однако во всех условиях снижение содержания нефтепродуктов в почвах происходит по экспоненте: содержание их резко падает в первые сроки, затем темпы снижаются [Мотузова, Карповарпенб, 2013]. Без вмешательства людей разложение токсинов биологических объектов может длиться десятки лет. Способность микроорганизмов к трансформации или деградации углеводородов нефти хорошо известна и позволяет использовать их для биоремедиации загрязненных территорий.
Некоторые группы микроорганизмов способны к использованию углеводородов нефти в качестве источника энергии, однако гены ответственные за такие свойства всё ещё остаются малоизученными. Штаммы таких специально отобранных бактерий используются для биоремедиации загрязненных территорий. Препарат «Абориген» разработан для биологической очистки водоёмов от нефти. В основе препарата - углеводородокисляющие микроорганизмы, Acinetobacter junii В-1316, Olemonas sp. В-1317, Acinetobacter calcoaceticus В-1318, Pseudomonas sp. 2Н, Bacillus licheniformis LZ-1e, Bacillus subtilis B10, которые используют нефтепродукты в качестве источника энергии, окисляя и разлагая их до нетоксичных веществ [Франк и др., 2020]. Так как штаммы консорциума были выделены из районов северных широт, они показали высокую устойчивость к суровым климатических условиям. Полевые испытания показали эффективность деструкции нефти под действием биопрепарата «Абориген» -в среднем по восьми опытным участкам суммарное содержание нефтепродуктов в почве было снижено в 12,4 раз за три месяца.
Целью данной магистерской диссертации является поиск и анализ нуклеотидной последовательности генов ферментов, ответственных за биодеградацию алканов и аренов, и, в частности нафталина, в плазмидной ДНК штаммов консорциума микроорганизмов "Абориген".
Задачами исследования являются:
• Подбор оптимальных праймеров для поиска нуклеотидной последовательности генов ферментов, участвующих в биодеградации различных фракций нефти, в частности аренов и алканов, методом ПНР
• Подбор оптимальных праймеров для поиска генов ферментов, участвующих в метаболизме нафталина методом ПНР
• Анализ наличия нуклеотидной последовательности отобранных генов ферментов, участвующих в метаболизме алканов и аренов, а также нафталина, в плазмидной ДНК штаммов консорциума «Абориген» методом ПНР
• Анализ роста биомассы штамма консорциума «Абориген» LZ-1eна среде с разной концентрацией нафталина
Исследования проводились на базе НИ ТГУ в лаборатории экологии, генетики и охраны окружающей среды. Автор выражает благодарность Коханенко Алине Андреевне и Франк Юлии Александровне за предоставленные материалы и руководство практической работы.
✅ Заключение
1. На основе литературных данных проведен поиск ферментов, участвующих в биодеградации аренов и алканов. Для алканов было выбрано 4 гена, а для аренов 15, из которых 11 участвуют в метаболизме нафталина. Проведена разработка праймеров ПЦР для анализа наличия нуклеотидных последовательностей выбранных генов.
2. Методом ПЦР выявлены нуклеотидные последовательности генов ферментов, участвующих в деградации аренов у штаммов консорциума «Абориген». Фрагмент гена толуолмонооксигеназы (xylM)обнаружен в плазмидной ДНК у штаммов B. subtilis B10, A. calcoaceticus B-1318, A. junii B-1316и Olemonas sp. B-1317.У штамма Pseudomonas sp. 2Н в плазмидной ДНК обнаружена нуклеотидная последовательность гена хлорбензин диоксигеназы (ahdA1).
3. У пяти штаммов консорциума «Абориген» были найдены последовательности гена нафталин диоксигеназы, что свидетельствует о возможности использования нафталина в качестве источника углерода. У всех штаммов прошла специфическая ПЦР реакция с праймерами генов pht3и catA, что косвенно указывает на возможность метаболизма штаммами консорциума нафталина как через орто-фталиевую, так и через салициловую кислоты.
4. Проанализирован рост биомассы штамма B. licheniformis LZ-1eна среде без и с добавлением нафталина при концентрациях 0.3, 0.7 и 1 г/л. Установлено, что при добавлении нафталина в среде количество биомассы увеличилось в среднем в 1.5 раза, что свидетельствует о использовании штаммом LZ-1eнафталина в своём метаболизме.