📄Работа №195917
Тема: РОЛЬ МЕТАЛЛОПРОТЕИНАЗЫ МЕЖКЛЕТОЧНОГО МАТРИКСА ADAMTS1 В ФОРМИРОВАНИИ ИНДИВИДУАЛЬНОЙ РАДИОЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ
Тип работы
Магистерская диссертация
Предмет
биология
Объем:
78 листов
Год:
2021
Просмотров:
73
4845
руб.
🛒 Купить работу
Не подходит эта работа?
Закажите новую по вашим требованиям
Узнать цену на написание
Закажите новую по вашим требованиям
Представленный материал является образцом учебного исследования, примером структуры и содержания учебного исследования по заявленной теме. Размещён исключительно в информационных и ознакомительных целях.
Workspay.ru оказывает информационные услуги по сбору, обработке и структурированию материалов в соответствии с требованиями заказчика.
Размещение материала не означает публикацию произведения впервые и не предполагает передачу исключительных авторских прав третьим лицам.
Материал не предназначен для дословной сдачи в образовательные организации и требует самостоятельной переработки с соблюдением законодательства Российской Федерации об авторском праве и принципов академической добросовестности.
Авторские права на исходные материалы принадлежат их законным правообладателям. В случае возникновения вопросов, связанных с размещённым материалом, просим направить обращение через форму обратной связи.
Настоящий учебно-методический информационный материал размещён в ознакомительных и исследовательских целях и представляет собой пример учебного исследования. Не является готовым научным трудом и требует самостоятельной переработки.
📋 Содержание
ВВЕДЕНИЕ 5
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8
1.1 Биологические эффекты ионизирующего излучения 8
1.1.1 Основные характеристики ионизирующего излучения 8
1.1.2 Временная шкала радиобиологических эффектов 9
1.1.3 Механизмы воздействия малых и больших доз 13
1.1.4 Индивидуальная радиочувствительность 20
1.2 Радиационно-индуцированный ответ 22
1.2.1 Антиоксидантная защита 23
1.2.2 Узнавание повреждений ДНК 24
1.2.3 Репарация ДНК 25
1.2.4 Регуляция клеточного цикла и апоптоз 29
1.2.5 Иммунный ответ 30
1.3 Вне- и внутриклеточный сигналинг 33
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 43
2.1 Материалы исследования 43
2.2 Схема эксперимента 43
2.3 Обеспечение нокаута и сверхэкспрессии гена ADAMTS1 44
2.4 Культивирование и облучение клеточных линий 45
2.5 Оценка клональной выживаемости 46
2.6 Анализ частоты микроядер 46
2.7 Полнотранскриптомный анализ 46
2.7.1 Выделение РНК 46
2.7.2 Очистка РНК 47
2.7.3 Оценка качества РНК 48
2.7.4 Введение флуоресцентной метки в образец РНК 48
2.7.5 Очистка флуоресцентно-меченных образцов РНК 48
2.7.6 Гибридизация меченых образцов РНК на микрочипах 49
2.8 Количественная ПЦР в режиме реального времени 49
2.8.1 Разработка и проверка эффективности олигонуклеотидных праймеров 50
2.8.2 Проведение ПЦР в режиме реального времени 53
2.9 Статистическая обработка данных 54
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 66
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8
1.1 Биологические эффекты ионизирующего излучения 8
1.1.1 Основные характеристики ионизирующего излучения 8
1.1.2 Временная шкала радиобиологических эффектов 9
1.1.3 Механизмы воздействия малых и больших доз 13
1.1.4 Индивидуальная радиочувствительность 20
1.2 Радиационно-индуцированный ответ 22
1.2.1 Антиоксидантная защита 23
1.2.2 Узнавание повреждений ДНК 24
1.2.3 Репарация ДНК 25
1.2.4 Регуляция клеточного цикла и апоптоз 29
1.2.5 Иммунный ответ 30
1.3 Вне- и внутриклеточный сигналинг 33
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 43
2.1 Материалы исследования 43
2.2 Схема эксперимента 43
2.3 Обеспечение нокаута и сверхэкспрессии гена ADAMTS1 44
2.4 Культивирование и облучение клеточных линий 45
2.5 Оценка клональной выживаемости 46
2.6 Анализ частоты микроядер 46
2.7 Полнотранскриптомный анализ 46
2.7.1 Выделение РНК 46
2.7.2 Очистка РНК 47
2.7.3 Оценка качества РНК 48
2.7.4 Введение флуоресцентной метки в образец РНК 48
2.7.5 Очистка флуоресцентно-меченных образцов РНК 48
2.7.6 Гибридизация меченых образцов РНК на микрочипах 49
2.8 Количественная ПЦР в режиме реального времени 49
2.8.1 Разработка и проверка эффективности олигонуклеотидных праймеров 50
2.8.2 Проведение ПЦР в режиме реального времени 53
2.9 Статистическая обработка данных 54
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 66
📖 Введение
Лучевая терапия наряду с химиотерапией и хирургическими методами является на сегодняшний день одним из основных подходов к лечению рака. В течение нескольких последних десятилетий были достигнуты значительные успехи в применении лучевой терапии, что привело к повышению выживаемости пациентов со злокачественными новообразованиями. Однако успешное применение данного метода осложняется по двум причинам: радиорезистентность клеток опухоли и повреждение клеток нормальной ткани, находящихся в области воздействия ионизирующего излучения. Эти ограничения требуют разработки способов либо радиосенсибилизации опухолевых клеток, либо защиты клеток нормальной ткани от воздействия ионизирующего излучения [Maier et al., 2016]. Поскольку радиочувствительность - во многом генетически детерминированное качество клетки, ткани и организма в целом, поиск путей решения обозначенной выше проблемы необходимо начать с анализа вклада различных генов в формирование индивидуальной радиочувствительности. Таким образом, выявление и всестороннее изучение генов, определяющих индивидуальную радиочувствительность человека, является одной из приоритетных задач в современной лучевой терапии онкологических заболеваний.
В основе индивидуальной радиочувствительности лежат процессы ответа на повреждение ДНК, а именно — процесс репарации, а также различные сигнальные пути [Borras-Fresneda et al., 2016]. В последнее время всё большая роль в ответе на повреждение ДНК отводится сигнальным путям, включающим взаимодействие с межклеточным матриксом [Eke and Cordes, 2011]. Более того, некоторые авторы приводят исследования роли матрикса в списке ключевых направлений, определяющих будущее радиобиологии [Kirsch et al., 2018]. В связи с этим, возможно, что сигнальные пути с участием компонентов межклеточного матрикса могут играть важную роль в механизмах ответа клеток на радиационно-индуцированное повреждение ДНК и вносить существенный вклад в формирование индивидуальной радиочувствительности человека. Однако, сигнальные пути, связывающие компоненты межклеточного матрикса с процессами ответа на повреждение ДНК, остаются недостаточно исследованными. Выявление механизмов регуляции экспрессии генов, принимающих участие в ответе клеток на повреждение ДНК, позволит глубже понять реализацию такого ответа, расширить имеющиеся представления об отдельных сигнальных путях и, потенциально, связать между собой различные пути регуляции репарации ДНК.
Ранее в лаборатории цитогенетики НИИ медицинской генетики Томского НИМЦ (г. Томск) были проведены исследования, выявившие гены, дифференциальная экспрессия которых оказалась связана с эффективностью репарации двунитевых разрывов ДНК [Васильев et al., 2015]. Для сравнения были выбраны две группы людей: с наиболее высоким спонтанным уровнем фокусов белков yH2AX, являющихся маркерами эффективности процессов репарации ДНК, при наименьшей частоте радиационно-индуцированных центромеро-негативных микроядер, отражающих уровень повреждения ДНК, и наоборот (с наименее высоким уровнем фокусов при наибольшей частоте микроядер). Проведение полнотранскриптомного анализа и сравнение профилей экспрессии генов между данными группами позволило выявить более 500 дифференциально -экспрессирующихся генов. Ген ADAMTS1был выбран для последующего изучения. Связь дифференциальной экспрессии данного гена с эффективностью репарации двунитевых разрывов ДНК была подтверждена в двух различных типах клеток: лимфоцитах периферической крови и фибробластах экстраэмбриональной мезодермы.
Продуктом гена ADAMTS1(дезинтегрин и металлопротеиназа с мотивом тромбоспондина 1) является эндопептидаза межклеточного матрикса [Bourd-Boittin et al., 2011], что, на основе вышесказанного, позволяет сделать предположения о его возможной роли в формировании радиационно-индуцированного ответа клеток. Проверка данных предположений требует проведения исследований в модельных системах in vitro,в частности — клеточной линии, нокаутной по данному гену, и линией со сверхэкспрессией данного гена. Кроме того, учитывая, что в предварительных исследованиях индивиды отличались по уровню экспрессии множества генов, потенциально продукт гена ADAMTS1 может участвовать в путях транскрипционной регуляции. Установление путей такой регуляции возможно с помощью проведения полнотранскриптомного анализа профилей экспрессии генов.
Цель диссертационной работы — изучение роли металлопротеиназы межклеточного матрикса ADAMTS1 в формировании индивидуальной радиочувствительности.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
1. Определить влияние нокаута гена ADAMTS1на радиационно-индуцированный ответ в клетках посредством оценки клональной выживаемости и частоты микроядер.
2. Провести анализ влияния сверхэкспрессии гена ADAMTS1на радиационно- индуцированный ответ в клетках посредством оценки частоты микроядер.
3. Оценить влияние ADAMTS1на экспрессионный профиль в клеточной линии HeLa.
Работа выполнена на базе лаборатории цитогенетики НИИ медицинской генетики Томского НИМЦ под руководством доктора биологических наук Васильева Станислава Анатольевича.
В основе индивидуальной радиочувствительности лежат процессы ответа на повреждение ДНК, а именно — процесс репарации, а также различные сигнальные пути [Borras-Fresneda et al., 2016]. В последнее время всё большая роль в ответе на повреждение ДНК отводится сигнальным путям, включающим взаимодействие с межклеточным матриксом [Eke and Cordes, 2011]. Более того, некоторые авторы приводят исследования роли матрикса в списке ключевых направлений, определяющих будущее радиобиологии [Kirsch et al., 2018]. В связи с этим, возможно, что сигнальные пути с участием компонентов межклеточного матрикса могут играть важную роль в механизмах ответа клеток на радиационно-индуцированное повреждение ДНК и вносить существенный вклад в формирование индивидуальной радиочувствительности человека. Однако, сигнальные пути, связывающие компоненты межклеточного матрикса с процессами ответа на повреждение ДНК, остаются недостаточно исследованными. Выявление механизмов регуляции экспрессии генов, принимающих участие в ответе клеток на повреждение ДНК, позволит глубже понять реализацию такого ответа, расширить имеющиеся представления об отдельных сигнальных путях и, потенциально, связать между собой различные пути регуляции репарации ДНК.
Ранее в лаборатории цитогенетики НИИ медицинской генетики Томского НИМЦ (г. Томск) были проведены исследования, выявившие гены, дифференциальная экспрессия которых оказалась связана с эффективностью репарации двунитевых разрывов ДНК [Васильев et al., 2015]. Для сравнения были выбраны две группы людей: с наиболее высоким спонтанным уровнем фокусов белков yH2AX, являющихся маркерами эффективности процессов репарации ДНК, при наименьшей частоте радиационно-индуцированных центромеро-негативных микроядер, отражающих уровень повреждения ДНК, и наоборот (с наименее высоким уровнем фокусов при наибольшей частоте микроядер). Проведение полнотранскриптомного анализа и сравнение профилей экспрессии генов между данными группами позволило выявить более 500 дифференциально -экспрессирующихся генов. Ген ADAMTS1был выбран для последующего изучения. Связь дифференциальной экспрессии данного гена с эффективностью репарации двунитевых разрывов ДНК была подтверждена в двух различных типах клеток: лимфоцитах периферической крови и фибробластах экстраэмбриональной мезодермы.
Продуктом гена ADAMTS1(дезинтегрин и металлопротеиназа с мотивом тромбоспондина 1) является эндопептидаза межклеточного матрикса [Bourd-Boittin et al., 2011], что, на основе вышесказанного, позволяет сделать предположения о его возможной роли в формировании радиационно-индуцированного ответа клеток. Проверка данных предположений требует проведения исследований в модельных системах in vitro,в частности — клеточной линии, нокаутной по данному гену, и линией со сверхэкспрессией данного гена. Кроме того, учитывая, что в предварительных исследованиях индивиды отличались по уровню экспрессии множества генов, потенциально продукт гена ADAMTS1 может участвовать в путях транскрипционной регуляции. Установление путей такой регуляции возможно с помощью проведения полнотранскриптомного анализа профилей экспрессии генов.
Цель диссертационной работы — изучение роли металлопротеиназы межклеточного матрикса ADAMTS1 в формировании индивидуальной радиочувствительности.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
1. Определить влияние нокаута гена ADAMTS1на радиационно-индуцированный ответ в клетках посредством оценки клональной выживаемости и частоты микроядер.
2. Провести анализ влияния сверхэкспрессии гена ADAMTS1на радиационно- индуцированный ответ в клетках посредством оценки частоты микроядер.
3. Оценить влияние ADAMTS1на экспрессионный профиль в клеточной линии HeLa.
Работа выполнена на базе лаборатории цитогенетики НИИ медицинской генетики Томского НИМЦ под руководством доктора биологических наук Васильева Станислава Анатольевича.
ИЛИ
Поиск аналога
📕 Список литературы
🛒 Оформить заказ
⚡ Работу высылаем в течении 5 минут после оплаты.