Разработка методов диагностики глиомы на основе методов ТГц спектроскопии, спектроскопии комбинационного рассеяния и машинного обучения
|
Аннотация
ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, СИМВОЛОВ, СОКРАЩЕНИЙ,
ТЕРМИНОВ 3
ВВЕДЕНИЕ 5
1. МЕТОДЫ И МАТЕРИАЛЫ ТГЦ СПЕКТРОСКОПИИ 13
1.1 ИССЛЕДУЕМЫЕ ОБРАЗЦЫ 13
1.2 МЕТОДЫ ТГЦ СПЕКТРОСКОПИИ 15
1.3 МЕТОДЫ МАШИННОГО ОБУЧЕНИЯ ДЛЯ АНАЛИЗА ТГЦ СПЕКТРОВ
ОБРАЗОВ КРОВИ 18
1.4 РЕЗУЛЬТАТЫ АНАЛИЗА ТГЦ СПЕКТРОВ ИССЛЕДУЕМЫХ ОБРАЗЦОВ 22
1.5 ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМОСВЯЗИ МЕЖДУ РАЗМЕРОМ ОПУХОЛИ И ТГЦ СПЕКТРАЛЬНЫМ ПРОФИЛЕМ СЫВОРОТКИ КРОВИ МЕТОДОМ РЕГРЕССИИ LASSO 35
1.6 ВЫВОДЫ К ГЛАВЕ 1 3 7
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ СПЕКТРОСКОПИИ КОМБИНАЦИОННОГО
РАССЕЯНИЯ 38
2.1 ИССЛЕДУЕМЫЕ ОБРАЗЦЫ 3 8
2.3 МЕТОДЫ МАШИННОГО ОБУЧЕНИЯ ДЛЯ АНАЛИЗА КР СПЕКТРОВ
ИССЛЕДУЕМЫХ ОБРАЗЦОВ 39
2.4 РЕЗУЛЬТАТЫ АНАЛИЗА КР СПЕКТРОВ ИССЛЕДУЕМЫХ ОБРАЗОВ 41
2.5 ВЫВОДЫ К ГЛАВЕ 2 53
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 58
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ И КОНФЕРЕНЦИЙ 59
ЛИТЕРАТУРА 61
ПРИЛОЖЕНИЯ 72
ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, СИМВОЛОВ, СОКРАЩЕНИЙ,
ТЕРМИНОВ 3
ВВЕДЕНИЕ 5
1. МЕТОДЫ И МАТЕРИАЛЫ ТГЦ СПЕКТРОСКОПИИ 13
1.1 ИССЛЕДУЕМЫЕ ОБРАЗЦЫ 13
1.2 МЕТОДЫ ТГЦ СПЕКТРОСКОПИИ 15
1.3 МЕТОДЫ МАШИННОГО ОБУЧЕНИЯ ДЛЯ АНАЛИЗА ТГЦ СПЕКТРОВ
ОБРАЗОВ КРОВИ 18
1.4 РЕЗУЛЬТАТЫ АНАЛИЗА ТГЦ СПЕКТРОВ ИССЛЕДУЕМЫХ ОБРАЗЦОВ 22
1.5 ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМОСВЯЗИ МЕЖДУ РАЗМЕРОМ ОПУХОЛИ И ТГЦ СПЕКТРАЛЬНЫМ ПРОФИЛЕМ СЫВОРОТКИ КРОВИ МЕТОДОМ РЕГРЕССИИ LASSO 35
1.6 ВЫВОДЫ К ГЛАВЕ 1 3 7
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ СПЕКТРОСКОПИИ КОМБИНАЦИОННОГО
РАССЕЯНИЯ 38
2.1 ИССЛЕДУЕМЫЕ ОБРАЗЦЫ 3 8
2.3 МЕТОДЫ МАШИННОГО ОБУЧЕНИЯ ДЛЯ АНАЛИЗА КР СПЕКТРОВ
ИССЛЕДУЕМЫХ ОБРАЗЦОВ 39
2.4 РЕЗУЛЬТАТЫ АНАЛИЗА КР СПЕКТРОВ ИССЛЕДУЕМЫХ ОБРАЗОВ 41
2.5 ВЫВОДЫ К ГЛАВЕ 2 53
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 58
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ И КОНФЕРЕНЦИЙ 59
ЛИТЕРАТУРА 61
ПРИЛОЖЕНИЯ 72
По частоте появления глиомы составляют около 80% злокачественных опухолей головного мозга [1]. По международной классификации (World Health Organization) глиомы разделяют на четыре степени злокачественности (WHO Grade I, II, III, IV). К первой степени злокачественности отнесены опухоли с потенциальной возможностью практически полного хирургического излечения. Вторая степень была присвоена инфильтративным опухолям с высокой вероятностью выживаемости не менее 5 лет. К признакам опухолей третьей степени злокачественности были отнесены атипия клеточных ядер в сочетании с высокой пролиферативной активностью, резистентностью к лечению, высокой вероятностью продолженного роста и медианой выживаемости 2-3 года. Четвертая степень злокачественности ассоциирована с высокой митотической активностью, наличием большого числа некрозов и крайне высокой вероятностью рецидива после удаления. Классическим представителем этого типа опухолей является МГБ [2], которая составляет около 55% всех глиом. Прогноз у пациентов с первично выявленной ГБ в настоящее время неутешительный, а медиана выживаемости в среднем составляет чуть более одного года. Даже при применении радиотерапии, химиотерапии и хирургического вмешательства для многих видов глиом характерен неблагоприятный прогноз [3]. Высокий социальный и экономический ущерб, наносимый этим заболеванием, обусловлен поражением трудоспособной части населения и нарушением функций центральной нервной системы с неуклонной инвалидизацией таких пациентов и необходимостью постоянного постороннего ухода. Поэтому актуальным и важным является выявление глиом на ранней стадии и разработка неинвазивных и малоинвазивных методов контроля эффективности лечения.
ГБ подразделяют на первичный и вторичный подтипы, которые имеют различные патогенетические пути развития, поражают пациентов определенного возраста и имеют различную тактику лечения. Гистологически эти подтипы неразличимы. Первичные (de novo) ГБ составляют 80-90% этих опухолей и встречаются у пожилых пациентов (средний возраст 55 - 62 года). Вторичные ГБ развиваются из астроцитом или олигодендроглиом меньшей степени злокачественности и встречаются у более молодых пациентов (средний возраст 40 - 45 лет) [4, 5]. Выделены различные генетические нарушения, характерные для первичного и вторичного подтипов ГБ, из которых наличие мутаций в генах, кодирующих изоцитратдегидрогеназу 1 и 2, является наиболее надежным молекулярным маркером, обнаруженным во всех случаях вторичных и только в 5-10% первичных ГБ [6]. Наличие мутаций IDH1/2 приводит к накоплению энантиомеров 2-гидроксиглутарата, делает клетки более восприимчивыми к генетическим перестройкам, вызванным оксидативным стрессом и, таким образом, является движущей силой развития глиом. С другой стороны, опухолевые клетки, содержащие мутации IDH1/2 более восприимчивы к противоопухолевой терапии, обладающей цитотоксическим действием за счет образования активных форм кислорода [5]. Медиана выживаемости колеблется от 24 до 36 месяцев при ГБ с IDH мутацией по сравнению с 9 до 15 месяцев при ГБ с IDH дикого типа. Пятилетняя выживаемость при вторичных ГБ составляет до 80% [5, 6]. Считают, что 2- гидроксиглутарат может быть идеальным маркером как диагностики, так и направленной терапии ГБ [6]. Поэтому определение его в тканях мозга и крови очень актуально.
В настоящее время неинвазивным методом диагностики глиомы является магнитно-резонансная томография. Кроме того, магнитно-резонансная спектроскопия является новым методом ранней диагностики опухоли и прогноза ее лечения, поскольку соотношение ряда метаболитов изменяется с появлением опухоли и в динамике ее развития [7, 8]. Было показано, что соотношения холинМ-ацетиласпартат, холин/креатинин, холин+креатинин/N- ацетиласпартат были значительно выше в опухолях высокой степени злокачественности, чем в опухолях низкой степени [9]. Высокие уровни холина были обнаружены в опухолях высокой степени злокачественности, а высокое отношение липид/лактат - при метастазировании опухоли головного мозга [10]. Применение МРС для неинвазивного количественного определения 2- гидроксиглутарата в головном мозге было показано относительно недавно. Это связано с мешающим влиянием ряда других метаболитов, присутствующих в тканях мозга [11]. Было показано применение жидкостной хроматографии в тандеме с масс-спектрометрией для определения 2-гидроксиглутарата в сыворотке крови [12,13] и спиномозговой жидкости [14]. С помощью этого же метода в крови были обнаружены и другие молекулярные маркеры, по которым можно провести раннюю диагностику ГБ [15]. Показано, что концентрации в плазме крови альфа-2-гликопротеина, C-реактивного белка и C9 компонента комплемента показали значительную положительную корреляцию с размером опухоли (R2 = 0,534, 0,495 и 0,452 соответственно) [16]. Было показано, что протеом и метаболом крови значительно изменяется при глиомах головного мозга [17].
Таким образом, все перечисленные технологии для неинвазивного и малоинвазивного определения молекулярных маркеров для ранней диагностики глиом в тканях и жидкостях организма являются достаточно трудоемкими и дорогостоящими. Именно поэтому разработка новых, в том числе спектроскопических методов для ранней диагностики глиом головного мозга является актуальной проблемой современной физики и медицины.
Интенсивное развитие получил новый вид спектроскопии - терагерцовая импульсная спектроскопия, которая имеет ряд особенностей, определяющих ее применение в создании новых методов неинвазивной и малоинвазивной диагностики. Отличительной особенностью метода является возможность непосредственного измерения показателя преломления, коэффициента поглощения и спектра диэлектрической функции исследуемого образца [18]. Это позволяет получить подробную спектральную характеристику анализируемой пробы за одно измерение, что в перспективе дает возможность развития на этой основе экспресс-диагностики [19]. Молекулярные кристаллы имеют характеристические линии поглощения в ТГц диапазоне частот, что позволяет применять метод ТГц спектроскопии для идентификации веществ [20]. Развитие технологии получения метаматериалов позволяет существенно повысить чувствительность обнаружения веществ с помощью ТГц спектроскопии [21]. Данная технология стала развиваться недавно и еще не применяется для обнаружения молекулярных маркеров глиом.
В статье [22] показано применение ИК-Фурье спектроскопии для диагностики мутации изоцитратдегидрогеназы в тканях глиомы человека. Показано, что изменение интенсивности полос при 1103, 1362, 1441, 1485 и 1553 см-1 позволяет на 88% отнести образцы к генотипу IDH1 глиомы.
Анализ спектров комбинационного рассеяния выявил увеличение интенсивности спектральных полос, связанных с ДНК, в мутантной глиоме IDH1, тогда как полосы, связанные с молекулярными колебаниями липидов, были значительно уменьшены. Более того, интенсивности КР полос, связанных с белками, различались в мутанте IDH1 и глиоме дикого типа IDH1, что указывает на изменения в профиле белков. Выбор из пяти полос (498, 826, 1003, 1174 и 1337 см-1) позволил классифицировать спектры комбинационного рассеяния по генотипу IDH1 с 89% вероятности. Авторы утверждают, что КР спектроскопия представляет собой простую, быструю и безопасную технику для определения мутации IDH1, которая показывает большие перспективы для клинически значимой диагностики in situ [23, 24].
Недавно были изучены ИК-спектры поглощения высушенных капель плазмы крови у пациентов с опухолями головного мозга. Были оценены возможности использования ИК спектров поглощения в качестве источника дополнительной информации, способствующей правильной диагностике [25]. Было показано, что наиболее информативной областью является область 1200— 950 см-1. Эта область позволяет выявить весь спектр веществ, содержащих связи Р-О и С-О, простые и сложные эфирные связи С-ОО, Р-ОО, которые присутствуют в липидах, фосфорилированных белках, углеводах, креатинфосфокиназах и других соединениях. Для диагностики определяли высоту пиков полос поглощения с максимумами 1195, 1170, 1155, 1127,1124, 1121, 1115, 1106, 1098, 1093, 1080 и 1045 см-1. Для исключения ошибок при оценке результатов ИК спектроскопических исследований в расчет принимали не абсолютные значения величин пиков полос поглощения, а их соотношение (см-1/см-1): 1 - 1170/1145, 2 - 1170/1080, 3 -1170/1093, 4 - 1170/1098, 5 - 1170/1106, 6 - 1170/1115, 7 -1170/1121, 8 - 1170/1124, 9 -1170/1127, 10 - 1170/1157, 11 - 1170/1195.
Методы машинного обучения используются для анализа данных, представленных в виде многокомпонентных векторов в многомерном пространстве. Такие вектора называются векторами признаков (англ. feature vectors), а пространство - пространством векторов признаков (англ. feature vector space) [26]. Методы машинного обучения разделяют на обучение с учителем (англ. Supervised learning) или классификации [27], обучение без учителя (англ. Unsupervised learning) или кластеризация [28], обучение с частичным привлечением учителя (англ. Semi-Supervised learning) [29] и обучение с подкреплением (англ. Reinforcement learning) [30]. Для методов обучения с учителем важно наличие размеченных экспертом данных. Обучение без учителя опирается на заданное экспертом количество классов или топологические свойства пространства признаков. Обучение с частичным привлечением учителя представляет собой комбинацию первых и вторых методов и использует методы кластеризации для расширения набора размеченных данных. Методы обучения с подкреплением работают по принципу алгоритмов с обратной связью, схожи с методами классификации, но обучаются не на размеченных данных, а на основе отклика внешней среды. Чаще всего встречается задача бинарной классификации, т.е. когда количество классов данных равно двум, например, здоровые и больные....
ГБ подразделяют на первичный и вторичный подтипы, которые имеют различные патогенетические пути развития, поражают пациентов определенного возраста и имеют различную тактику лечения. Гистологически эти подтипы неразличимы. Первичные (de novo) ГБ составляют 80-90% этих опухолей и встречаются у пожилых пациентов (средний возраст 55 - 62 года). Вторичные ГБ развиваются из астроцитом или олигодендроглиом меньшей степени злокачественности и встречаются у более молодых пациентов (средний возраст 40 - 45 лет) [4, 5]. Выделены различные генетические нарушения, характерные для первичного и вторичного подтипов ГБ, из которых наличие мутаций в генах, кодирующих изоцитратдегидрогеназу 1 и 2, является наиболее надежным молекулярным маркером, обнаруженным во всех случаях вторичных и только в 5-10% первичных ГБ [6]. Наличие мутаций IDH1/2 приводит к накоплению энантиомеров 2-гидроксиглутарата, делает клетки более восприимчивыми к генетическим перестройкам, вызванным оксидативным стрессом и, таким образом, является движущей силой развития глиом. С другой стороны, опухолевые клетки, содержащие мутации IDH1/2 более восприимчивы к противоопухолевой терапии, обладающей цитотоксическим действием за счет образования активных форм кислорода [5]. Медиана выживаемости колеблется от 24 до 36 месяцев при ГБ с IDH мутацией по сравнению с 9 до 15 месяцев при ГБ с IDH дикого типа. Пятилетняя выживаемость при вторичных ГБ составляет до 80% [5, 6]. Считают, что 2- гидроксиглутарат может быть идеальным маркером как диагностики, так и направленной терапии ГБ [6]. Поэтому определение его в тканях мозга и крови очень актуально.
В настоящее время неинвазивным методом диагностики глиомы является магнитно-резонансная томография. Кроме того, магнитно-резонансная спектроскопия является новым методом ранней диагностики опухоли и прогноза ее лечения, поскольку соотношение ряда метаболитов изменяется с появлением опухоли и в динамике ее развития [7, 8]. Было показано, что соотношения холинМ-ацетиласпартат, холин/креатинин, холин+креатинин/N- ацетиласпартат были значительно выше в опухолях высокой степени злокачественности, чем в опухолях низкой степени [9]. Высокие уровни холина были обнаружены в опухолях высокой степени злокачественности, а высокое отношение липид/лактат - при метастазировании опухоли головного мозга [10]. Применение МРС для неинвазивного количественного определения 2- гидроксиглутарата в головном мозге было показано относительно недавно. Это связано с мешающим влиянием ряда других метаболитов, присутствующих в тканях мозга [11]. Было показано применение жидкостной хроматографии в тандеме с масс-спектрометрией для определения 2-гидроксиглутарата в сыворотке крови [12,13] и спиномозговой жидкости [14]. С помощью этого же метода в крови были обнаружены и другие молекулярные маркеры, по которым можно провести раннюю диагностику ГБ [15]. Показано, что концентрации в плазме крови альфа-2-гликопротеина, C-реактивного белка и C9 компонента комплемента показали значительную положительную корреляцию с размером опухоли (R2 = 0,534, 0,495 и 0,452 соответственно) [16]. Было показано, что протеом и метаболом крови значительно изменяется при глиомах головного мозга [17].
Таким образом, все перечисленные технологии для неинвазивного и малоинвазивного определения молекулярных маркеров для ранней диагностики глиом в тканях и жидкостях организма являются достаточно трудоемкими и дорогостоящими. Именно поэтому разработка новых, в том числе спектроскопических методов для ранней диагностики глиом головного мозга является актуальной проблемой современной физики и медицины.
Интенсивное развитие получил новый вид спектроскопии - терагерцовая импульсная спектроскопия, которая имеет ряд особенностей, определяющих ее применение в создании новых методов неинвазивной и малоинвазивной диагностики. Отличительной особенностью метода является возможность непосредственного измерения показателя преломления, коэффициента поглощения и спектра диэлектрической функции исследуемого образца [18]. Это позволяет получить подробную спектральную характеристику анализируемой пробы за одно измерение, что в перспективе дает возможность развития на этой основе экспресс-диагностики [19]. Молекулярные кристаллы имеют характеристические линии поглощения в ТГц диапазоне частот, что позволяет применять метод ТГц спектроскопии для идентификации веществ [20]. Развитие технологии получения метаматериалов позволяет существенно повысить чувствительность обнаружения веществ с помощью ТГц спектроскопии [21]. Данная технология стала развиваться недавно и еще не применяется для обнаружения молекулярных маркеров глиом.
В статье [22] показано применение ИК-Фурье спектроскопии для диагностики мутации изоцитратдегидрогеназы в тканях глиомы человека. Показано, что изменение интенсивности полос при 1103, 1362, 1441, 1485 и 1553 см-1 позволяет на 88% отнести образцы к генотипу IDH1 глиомы.
Анализ спектров комбинационного рассеяния выявил увеличение интенсивности спектральных полос, связанных с ДНК, в мутантной глиоме IDH1, тогда как полосы, связанные с молекулярными колебаниями липидов, были значительно уменьшены. Более того, интенсивности КР полос, связанных с белками, различались в мутанте IDH1 и глиоме дикого типа IDH1, что указывает на изменения в профиле белков. Выбор из пяти полос (498, 826, 1003, 1174 и 1337 см-1) позволил классифицировать спектры комбинационного рассеяния по генотипу IDH1 с 89% вероятности. Авторы утверждают, что КР спектроскопия представляет собой простую, быструю и безопасную технику для определения мутации IDH1, которая показывает большие перспективы для клинически значимой диагностики in situ [23, 24].
Недавно были изучены ИК-спектры поглощения высушенных капель плазмы крови у пациентов с опухолями головного мозга. Были оценены возможности использования ИК спектров поглощения в качестве источника дополнительной информации, способствующей правильной диагностике [25]. Было показано, что наиболее информативной областью является область 1200— 950 см-1. Эта область позволяет выявить весь спектр веществ, содержащих связи Р-О и С-О, простые и сложные эфирные связи С-ОО, Р-ОО, которые присутствуют в липидах, фосфорилированных белках, углеводах, креатинфосфокиназах и других соединениях. Для диагностики определяли высоту пиков полос поглощения с максимумами 1195, 1170, 1155, 1127,1124, 1121, 1115, 1106, 1098, 1093, 1080 и 1045 см-1. Для исключения ошибок при оценке результатов ИК спектроскопических исследований в расчет принимали не абсолютные значения величин пиков полос поглощения, а их соотношение (см-1/см-1): 1 - 1170/1145, 2 - 1170/1080, 3 -1170/1093, 4 - 1170/1098, 5 - 1170/1106, 6 - 1170/1115, 7 -1170/1121, 8 - 1170/1124, 9 -1170/1127, 10 - 1170/1157, 11 - 1170/1195.
Методы машинного обучения используются для анализа данных, представленных в виде многокомпонентных векторов в многомерном пространстве. Такие вектора называются векторами признаков (англ. feature vectors), а пространство - пространством векторов признаков (англ. feature vector space) [26]. Методы машинного обучения разделяют на обучение с учителем (англ. Supervised learning) или классификации [27], обучение без учителя (англ. Unsupervised learning) или кластеризация [28], обучение с частичным привлечением учителя (англ. Semi-Supervised learning) [29] и обучение с подкреплением (англ. Reinforcement learning) [30]. Для методов обучения с учителем важно наличие размеченных экспертом данных. Обучение без учителя опирается на заданное экспертом количество классов или топологические свойства пространства признаков. Обучение с частичным привлечением учителя представляет собой комбинацию первых и вторых методов и использует методы кластеризации для расширения набора размеченных данных. Методы обучения с подкреплением работают по принципу алгоритмов с обратной связью, схожи с методами классификации, но обучаются не на размеченных данных, а на основе отклика внешней среды. Чаще всего встречается задача бинарной классификации, т.е. когда количество классов данных равно двум, например, здоровые и больные....
Основной целью работы было выявление глиомы путем обнаружения ее биомаркеров в сыворотке и плазме крови методами ТГц спектроскопии и спектроскопии комбинационного рассеяния. В работе исследовалась сыворотка крови мышей в динамике развития ГБ U87 (общепринятая модель глиомы человека, созданная в лабораторных, контролируемых условиях), а также сыворотка и плазма крови людей с глиомой и без нее. Для анализа ТГц и КР спектров образцов крови и выявления наиболее информативных частот были применены методы машинного обучения. Предложены соответствующие конвейеры обработки данных. Результаты валидированы методами 10-кратной перекрестной проверки. Для методов предварительной обработки исследуемых спектральных данных получены оптимальные значения подстроечных параметров. Выделены наборы информативных частот, соответствующих динамике изменения глиомы. Построена регрессионная модель, связывающая размеры опухоли и ТГц спектры. Также создана регресионная модель учитывающая взаимосвязь биомаркеров, выделенных методом МРС и ТГц/КР спектроскопии. Было показано, что по анализу сыворотки крови можно отследить изменение состояния тканей мозга во время развития глиомы. КР и ТГц спектроскопия в сочетании с машинным обучением позволяет проводить безметковый анализ тканей мозга или сыворотки крови в режиме реального времени, а также дифференцировать глиомы и быстро контролировать лечение.
Результаты работы опубликованы в 8 статьях, индексируемых в базах SCOPUS и Web of Science, апробированы на 8 конференциях международного и всероссийского уровня.
Результаты работы опубликованы в 8 статьях, индексируемых в базах SCOPUS и Web of Science, апробированы на 8 конференциях международного и всероссийского уровня.
