РЕАКЦИЯ МИКРОГЛИИ НА ЛОКАЛЬНОЕ ИШЕМИЧЕСКОЕ ПОРАЖЕНИЕ ГОЛОВНОГО МОЗГА У МЫШИ
|
Аннотация
ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ 4
ВВЕДЕНИЕ 5
1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 7
1.1 Микроглия в ЦНС 7
1.1.1 Происхождение резидентных макрофагов (микроглии) в ЦНС мышей 7
1.1.2 Особенности морфологии микроглиальных клеток 8
1.2 Функция микроглии в центральной нервной системе 10
1.3 Состояния микроглии 11
1.3.1 Покоящаяся и активированная микроглия 11
1.3.2 Причины активации микроглии 12
1.4 Ишемическое повреждение мозга 14
1.4.1 Ишемия головного мозга у людей 14
1.4.2 Животные модели ишемического поражения мозга МСАО 15
1.4.3 Модели для индукции очаговой (фокальной) ишемии головного мозга 16
1.4.4 Изучение ишемии головного мозга методом MCAO на грызунах в
лаборатории нейробиологии НИИ ББ ТГУ 18
1.5 Реакция глиальных клеток и нейронов на ишемическое повреждение головного
мозга мыши 20
1.5.1 Реакция глиальных клеток и нейронов спустя первые восемь часов после
ишемического инсульта 20
1.5.2 Реакция глиальных клеток и нейронов спустя 24 часа после ишемического
инсульта 21
1.6 Положительные эффекты ранней репепрфузии 22
1.7 Влияние изменения капиллярного кровотока на морфологию микроглии 23
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 25
2.1 Объект исследования 25
2.2 Моделирование локальной ишемии мозга у мышей 25
2.3 Оценка неврологического дефицита 27
2.4 Выведение из эксперимента, фиксация тканей, пробоподготовка 27
2.5 Иммуногистохимическое окрашивание срезов мозга антителами к маркерным
белкам клеток ЦНС 28
2.6 Микроскопирование, микрофотосъемка и обработка микрофотографий 29
3 РЕЗУЛЬТАТЫ 31
3.1 Полученный для исследования материал 31
3.2 Анализ распределения и морфологии Iba1+ клеток в мозге мыши через 1,5 часа
после реперфузии 31
3.3 Анализ распределения и морфологии Iba1+ клеток в мозге мыши через 3 часа
после реперфузии 33
3.4 Локализация и морфология микроглиоцитов, нейронов и астроцитов в головном
мозге мыши через 6 часов после реперфузии 34
3.4.1 Анализ распределения и морфологии Iba1+ клеток в мозге мыши через 6
часов после реперфузии 36
3.4.2 Зрелые нейроны и астроциты в головном мозге мыши через 6 часов после реперфузии 38
3.5 Локализация и морфология микроглиоцитов, нейронов и астроцитов в головном
мозге мыши через 1 день после реперфузии 40
3.5.1 Анализ распределения и морфологии Iba1+ клеток в головном мозге мыши
через 1 день после реперфузии 40
3.5.2 NeuN+ и GFAP+ клетки в головном мозге мыши через 1 день после
реперфузии 43
3.6 Локализация и морфология микроглиоцитов, нейронов и астроцитов в головном
мозге мыши через 2 дня после реперфузии 47
3.6.1 Анализ распределения и морфологии Iba1+ клеток в головном мозге мыши
через 2 дня после реперфузии 47
3.6.2 Анализ распределения и морфологии зрелых нейронов и фибриллярных
астроцитов в головном мозге мыши через 2 дня после реперфузии 50
ОБСУЖДЕНИЕ 52
ВЫВОДЫ 55
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
... раздел 3 отсуствует
ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ 4
ВВЕДЕНИЕ 5
1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 7
1.1 Микроглия в ЦНС 7
1.1.1 Происхождение резидентных макрофагов (микроглии) в ЦНС мышей 7
1.1.2 Особенности морфологии микроглиальных клеток 8
1.2 Функция микроглии в центральной нервной системе 10
1.3 Состояния микроглии 11
1.3.1 Покоящаяся и активированная микроглия 11
1.3.2 Причины активации микроглии 12
1.4 Ишемическое повреждение мозга 14
1.4.1 Ишемия головного мозга у людей 14
1.4.2 Животные модели ишемического поражения мозга МСАО 15
1.4.3 Модели для индукции очаговой (фокальной) ишемии головного мозга 16
1.4.4 Изучение ишемии головного мозга методом MCAO на грызунах в
лаборатории нейробиологии НИИ ББ ТГУ 18
1.5 Реакция глиальных клеток и нейронов на ишемическое повреждение головного
мозга мыши 20
1.5.1 Реакция глиальных клеток и нейронов спустя первые восемь часов после
ишемического инсульта 20
1.5.2 Реакция глиальных клеток и нейронов спустя 24 часа после ишемического
инсульта 21
1.6 Положительные эффекты ранней репепрфузии 22
1.7 Влияние изменения капиллярного кровотока на морфологию микроглии 23
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 25
2.1 Объект исследования 25
2.2 Моделирование локальной ишемии мозга у мышей 25
2.3 Оценка неврологического дефицита 27
2.4 Выведение из эксперимента, фиксация тканей, пробоподготовка 27
2.5 Иммуногистохимическое окрашивание срезов мозга антителами к маркерным
белкам клеток ЦНС 28
2.6 Микроскопирование, микрофотосъемка и обработка микрофотографий 29
3 РЕЗУЛЬТАТЫ 31
3.1 Полученный для исследования материал 31
3.2 Анализ распределения и морфологии Iba1+ клеток в мозге мыши через 1,5 часа
после реперфузии 31
3.3 Анализ распределения и морфологии Iba1+ клеток в мозге мыши через 3 часа
после реперфузии 33
3.4 Локализация и морфология микроглиоцитов, нейронов и астроцитов в головном
мозге мыши через 6 часов после реперфузии 34
3.4.1 Анализ распределения и морфологии Iba1+ клеток в мозге мыши через 6
часов после реперфузии 36
3.4.2 Зрелые нейроны и астроциты в головном мозге мыши через 6 часов после реперфузии 38
3.5 Локализация и морфология микроглиоцитов, нейронов и астроцитов в головном
мозге мыши через 1 день после реперфузии 40
3.5.1 Анализ распределения и морфологии Iba1+ клеток в головном мозге мыши
через 1 день после реперфузии 40
3.5.2 NeuN+ и GFAP+ клетки в головном мозге мыши через 1 день после
реперфузии 43
3.6 Локализация и морфология микроглиоцитов, нейронов и астроцитов в головном
мозге мыши через 2 дня после реперфузии 47
3.6.1 Анализ распределения и морфологии Iba1+ клеток в головном мозге мыши
через 2 дня после реперфузии 47
3.6.2 Анализ распределения и морфологии зрелых нейронов и фибриллярных
астроцитов в головном мозге мыши через 2 дня после реперфузии 50
ОБСУЖДЕНИЕ 52
ВЫВОДЫ 55
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
... раздел 3 отсуствует
Одной из самых распространенных причин нетрудоспособности среди населения, является инвалидность, как последствие ишемического инсульта. В настоящее время накоплен большой объем информации о структурных и функциональных характеристиках клеток нервной системы, организации медиаторных систем, генетике и эпигенетике ряда патологий, но этого пока недостаточно для разработки эффективных методов профилактики, ранней диагностики и лечения общеизвестных нейродегенеративных заболеваний, в том числе ишемического инсульта . Все нейродегенеративные заболевания объединяет прогрессирующая гибель нервных клеток (нейродегенерация), однако, первым ответом на аноксию, возникающую при ишемическом инсульте, является воспалительная реакция. Иммунный ответ в мозге после инсульта запускается белками, которые высвобождаются из мертвых и поврежденных клеток и вызывают активацию резидентных макрофагов центральной нервной системы - микроглиоцитов. На протяжении всей жизни микроглия регулирует гомеостаз нервной ткани, участвует в перестройке синапсов , а при инсульте вместе с периферическими иммунными клетками принимает непосредственное участие в процессе воспаления . Микроглиоциты способны быстро менять свой фенотип в ответ на любое нарушение гомеостаза нервной системы и активно фагоцитировать погибшие клетки. Однако, микроглия фагоцитирует не только погибшие, но и живые нейроны, которые подверглись гипоксии, но не погибли. Такие нейроны при восстановлении кровотока могли бы быстро восстановить свою активность, но из-за продолжающегося воспаления, которое активирует микроглию, гибнут. Из-за этого процесс реабилитации растягивается во времени, и не всегда человек может вернуться к исходному состоянию. Оказание своевременной медицинской помощи может значительно сократить время реабилитации после инсульта и напрямую зависит от ранней диагностики поражения. Однако, ранние стадии развития нейродегенеративных заболеваний, в том числе начало воспалительного процесса, еще очень плохо изучены.
Для изучения последствий ишемии и других расстройств кровообращения головного мозга у человека необходимы адекватные модели на животных. Грызуны являются одним из широко используемых объектов экспериментальных исследований для изучения патологии мозгового кровообращения и его влияния на морфофункциональные особенности коры головного мозга . Мы исследовали нейровоспаление, возникшее в результате фокальной ишемии головного мозга у мыши, вызванной окклюзией средней сонной артерии (MCAO).
Целью нашего исследования было изучение изменений локализации и морфологии микроглиоцитов в головном мозге мыши, происходящих после локальной ишемии головного мозга. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
1. Проанализировать локализацию микроглиоцитов в головном мозге мышей через 1.5, 3, 6 часов, 1 день и 2 дня после реперфузии.
2. Описать морфологию микроглиоцитов в головном мозге мышей через 1.5, 3, 6 часов, 1 день и 2 дня после реперфузии.
3. Сравнить локализацию и морфологию микроглиоцитов, нейронов и астроцитов в ишемическом очаге и по периферии очага.
Работа выполнена на базе лаборатории нейробиологии Научного Исследовательского Института биологии и биофизики ТГУ (НИИ ББ ТГУ) под руководством ст. н. с., доцента каф. генетики и клеточной биологии, к.б.н. Татьяны Викторовны Ананьиной.
Для изучения последствий ишемии и других расстройств кровообращения головного мозга у человека необходимы адекватные модели на животных. Грызуны являются одним из широко используемых объектов экспериментальных исследований для изучения патологии мозгового кровообращения и его влияния на морфофункциональные особенности коры головного мозга . Мы исследовали нейровоспаление, возникшее в результате фокальной ишемии головного мозга у мыши, вызванной окклюзией средней сонной артерии (MCAO).
Целью нашего исследования было изучение изменений локализации и морфологии микроглиоцитов в головном мозге мыши, происходящих после локальной ишемии головного мозга. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
1. Проанализировать локализацию микроглиоцитов в головном мозге мышей через 1.5, 3, 6 часов, 1 день и 2 дня после реперфузии.
2. Описать морфологию микроглиоцитов в головном мозге мышей через 1.5, 3, 6 часов, 1 день и 2 дня после реперфузии.
3. Сравнить локализацию и морфологию микроглиоцитов, нейронов и астроцитов в ишемическом очаге и по периферии очага.
Работа выполнена на базе лаборатории нейробиологии Научного Исследовательского Института биологии и биофизики ТГУ (НИИ ББ ТГУ) под руководством ст. н. с., доцента каф. генетики и клеточной биологии, к.б.н. Татьяны Викторовны Ананьиной.
Первые часы после ишемического инсульта особенно чувствительны к воздействиям (например, реперфузия) и являются критическими для дальнейшего развития воспаления и отмирания тканей. Таким терапевтическим окном являются первые 3-6 часов от развития ишемического инсульта [1]. Среди исследований по данной тематике встречаются различные временные точки, во время которых проводились исследования реакции мозга на ишемию: 1 час, 2 часа, 6 часов, 8 часов, 1 день, 3 дня, 7 дней после ишемического эпизода и далее . Как правило, в серии экспериментов окрашивание поставлено на одну группу маркеров (либо только нейронные, либо микроглиальные, либо астроцитарные). Двойное окрашивание с различными маркерами на одном срезе даёт больше деталей для сравнения реакций разных групп клеток на ишемическое повреждение в определенных структурах. Сочетание описания изменения морфологии различных типов клеток в ишемизированных и периферических областях более полно отражает картину развития воспаления и повреждения, опосредованного ишемическим инсультом.
Животные модели широко используются в исследованиях фокальной ишемии головного мозга . В своем исследовании мы изучали изменения, происходящие с клетками нервной ткани головного мозга мышей, перенесших локальную ишемию головного мозга (MCAO). Нами были выбраны временные точки: 1.5, 3, 6 часов, 1 и 2 дня после реперфузии.
Спустя 1,5 часа после ишемического инсульта (ишемический эпизод длился 1 час), окрашивание маркерам микроглии Ibal не показало явного очага поражения, встречаются только отдельные скопления или единичные скопления активированных Iba1+ клеток в испси- и контралатеральном полушариях. При анализе Iba1+ клеток спустя 3 часа после реперфузии, также не было заметно явных скоплений активированных микроглиоцитов, кроме визуального наблюдения увеличения общего числа таких клеток в обоих полушариях. Ввиду отсутствия МРТ контроля, нельзя оценить потенциальные участки повреждения, и каким образом происходила остановка кровотока посредством окклюзии СМА. Также, проведение оценки неврологического статуса в данном случае не позволяет судить о тяжести перенесенного инсульта, по причине того, что животное еще полностью не восстанавливается после наркоза. Другой причиной отсутствия централизованного очага воспаления может быть ранний период после реперфузии, когда еще не происходит массовое изменения морфологии клеток. Полученные нами результаты не противоречат
литературным данным, в которых явные и массовые морфологические изменения микроглии в ипсилатеральном полушарии обнаруживают спустя 2 часа после реперфузии . Гибель же нейронов описывают уже непосредственно после ишемического инсульта, спустя 0 часов после реперфузии. Однако, в данном случае ишемический эпизод длился 2 часа.
Выраженный ишемический очаг проявляется на корональных срезах мозга мыши спустя 6 часов после реперфузии. Так как удалось выделить границы пораженной ткани, были проведены окрашивания других клеток ЦНС (нейронов и астроцитов). Распределение и морфология микроглиоцитов в ипсилатеральном полушарии были неоднородными: В периферийной зоне, к которой мы отнесли моторную кору, соматосенсорную кору, вентромедиальную часть полосатого тела, микроглиоциты имели морфологию, схожую с той, что уже встречалась на корональных срезах спустя 1,5 и 3 часа после реперфузии: в основном это были клетки с нормальной морфологией. Встречались отдельные крупные, яркие Iba1+ клетки с длинными толстыми отростками и повышенной иммунореактивностью, а также Iba1+ клетки с короткими отростками. В полосатом теле выделялась область с микроглиоцитами, имеющими измененную морфологию - они не образовывали локальных скоплений, формировали разветвленную сетевидную структуру. Причем, в центральной зоне этой области произошла массовая гибель нейронов, а по ее периферии нейроны не погибли. По-видимому, это область - полутень, или пенумбра - это область ограниченного кровотока с частично сохраненным энергетическим обменом. Необычная морфология микроглиоцитов встречалась вдоль сосудов: клетки имели вытянутое тело и короткие отростки. Внутри сосудов встречались Iba1+ клетки амебоидного фенотипа. Так как маркер Iba1+ является характерным не только для микроглии, но и для макрофагов крови, вероятно, уже через 6 часов после реперфузии в ипсилатеральном полушарии присутствовали системные макрофаги (нейтрофилы и моноциты). В литературных данных макрофаги крови обнаруживались спустя 1 день после 90-минутного ишемического эпизода и спустя 2 часа после 60минутного МСАО. При окрашивании астроцитов антителами к GFAP не было выявлено различий между фибриллярными астроцитами ипси- и контралатерального полушария. Скопления реактивных астроцитов наблюдается в дорсальной части мозолистого тела обоих полушарий.
У животного, выведенного из эксперимента через 1 день после реперфузии очаг наблюдался за пределами базального ядра - в моторной и соматосенсорной коре, а также ишемическое поражение захватывало большую часть полосатого тела. В центральной области ишемического очага Iba1+ клетки отсутствуют. На периферии этой области
микроглиоциты отличаются повышенной иммунореактивностью, тела клеток выглядят крупнее, отростки короткие и толстые. В периферийных областях ипсилатерального полушария (вне очага) встречаются мигрирующие микроглиоциты с характерной морфологией: удлиненное тело, короткие отростки. Возникает асимметрия полушарий из- за отека, возникшего вследствие нарушения кровоснабжения головного мозга.
...
Животные модели широко используются в исследованиях фокальной ишемии головного мозга . В своем исследовании мы изучали изменения, происходящие с клетками нервной ткани головного мозга мышей, перенесших локальную ишемию головного мозга (MCAO). Нами были выбраны временные точки: 1.5, 3, 6 часов, 1 и 2 дня после реперфузии.
Спустя 1,5 часа после ишемического инсульта (ишемический эпизод длился 1 час), окрашивание маркерам микроглии Ibal не показало явного очага поражения, встречаются только отдельные скопления или единичные скопления активированных Iba1+ клеток в испси- и контралатеральном полушариях. При анализе Iba1+ клеток спустя 3 часа после реперфузии, также не было заметно явных скоплений активированных микроглиоцитов, кроме визуального наблюдения увеличения общего числа таких клеток в обоих полушариях. Ввиду отсутствия МРТ контроля, нельзя оценить потенциальные участки повреждения, и каким образом происходила остановка кровотока посредством окклюзии СМА. Также, проведение оценки неврологического статуса в данном случае не позволяет судить о тяжести перенесенного инсульта, по причине того, что животное еще полностью не восстанавливается после наркоза. Другой причиной отсутствия централизованного очага воспаления может быть ранний период после реперфузии, когда еще не происходит массовое изменения морфологии клеток. Полученные нами результаты не противоречат
литературным данным, в которых явные и массовые морфологические изменения микроглии в ипсилатеральном полушарии обнаруживают спустя 2 часа после реперфузии . Гибель же нейронов описывают уже непосредственно после ишемического инсульта, спустя 0 часов после реперфузии. Однако, в данном случае ишемический эпизод длился 2 часа.
Выраженный ишемический очаг проявляется на корональных срезах мозга мыши спустя 6 часов после реперфузии. Так как удалось выделить границы пораженной ткани, были проведены окрашивания других клеток ЦНС (нейронов и астроцитов). Распределение и морфология микроглиоцитов в ипсилатеральном полушарии были неоднородными: В периферийной зоне, к которой мы отнесли моторную кору, соматосенсорную кору, вентромедиальную часть полосатого тела, микроглиоциты имели морфологию, схожую с той, что уже встречалась на корональных срезах спустя 1,5 и 3 часа после реперфузии: в основном это были клетки с нормальной морфологией. Встречались отдельные крупные, яркие Iba1+ клетки с длинными толстыми отростками и повышенной иммунореактивностью, а также Iba1+ клетки с короткими отростками. В полосатом теле выделялась область с микроглиоцитами, имеющими измененную морфологию - они не образовывали локальных скоплений, формировали разветвленную сетевидную структуру. Причем, в центральной зоне этой области произошла массовая гибель нейронов, а по ее периферии нейроны не погибли. По-видимому, это область - полутень, или пенумбра - это область ограниченного кровотока с частично сохраненным энергетическим обменом. Необычная морфология микроглиоцитов встречалась вдоль сосудов: клетки имели вытянутое тело и короткие отростки. Внутри сосудов встречались Iba1+ клетки амебоидного фенотипа. Так как маркер Iba1+ является характерным не только для микроглии, но и для макрофагов крови, вероятно, уже через 6 часов после реперфузии в ипсилатеральном полушарии присутствовали системные макрофаги (нейтрофилы и моноциты). В литературных данных макрофаги крови обнаруживались спустя 1 день после 90-минутного ишемического эпизода и спустя 2 часа после 60минутного МСАО. При окрашивании астроцитов антителами к GFAP не было выявлено различий между фибриллярными астроцитами ипси- и контралатерального полушария. Скопления реактивных астроцитов наблюдается в дорсальной части мозолистого тела обоих полушарий.
У животного, выведенного из эксперимента через 1 день после реперфузии очаг наблюдался за пределами базального ядра - в моторной и соматосенсорной коре, а также ишемическое поражение захватывало большую часть полосатого тела. В центральной области ишемического очага Iba1+ клетки отсутствуют. На периферии этой области
микроглиоциты отличаются повышенной иммунореактивностью, тела клеток выглядят крупнее, отростки короткие и толстые. В периферийных областях ипсилатерального полушария (вне очага) встречаются мигрирующие микроглиоциты с характерной морфологией: удлиненное тело, короткие отростки. Возникает асимметрия полушарий из- за отека, возникшего вследствие нарушения кровоснабжения головного мозга.
...
Подобные работы
- ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФЕНОТИПА МИКРОГЛИИ НА ОСТРОЙ СТАДИИ ЛОКАЛЬНОГО
ИШЕМИЧЕСКОГО ИНСУЛЬТА МОЗГА У МЫШИ
Бакалаврская работа, биология. Язык работы: Русский. Цена: 4800 р. Год сдачи: 2023