ВВЕДЕНИЕ 2
1 Современные подходы к культивированию микроорганизмов подземной
«глубинной биосферы» 4
1.1 «Глубинная биосфера» как уникальное местообитание 4
1.2 Проблема культивирования «сложнокультивируемых»
микроорганизмов 6
1.3 Использование разнообразных доноров электронов для успешного
культивирования микроорганизмов 10
1.4 Сульфатредуцирующие прокариоты в условиях «глубинной биосферы»
17
1.5 Роль бактериофагов в условиях «глубинной биосферы» 19
2 Материалы и методы 22
2.1 Объекты исследования 22
2.2 Микробиологический посев и работа в ламинарном боксе 26
2.3 Подготовка посуды для культивирования 29
2.4 Приготовление питательной среды 29
2.5 Посев для получения колоний на плотной среде Методом Коха 31
2.6 Метод предельных разведений в жидкой среде 32
2.7 Метод прямого учета численности клеток путем микроскопирования . 33
2.8 Методика осаждения клеток для трансмиссионной электронной
микроскопии 34
3 Результаты и обсуждение 36
3.1 Культивирование сульфидогенных бактерий из подземной термальной
воды глубинной скважины 1-Р в Томской области 36
3.2 Поиск бактериофага в культурах 38
3.3 Изучение физиологии чистой культуры Thermodesulfovibrio sp.N1 40
3.4 Изучение физиологии чистой культуры Thermodesulfovibrio sp. V2 42
ВЫВОДЫ 44
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 45
ЛИТЕРАТУРА
... 2 и 3 разделы отсутсвуют
Существование жизни в земной коре на больших глубинах было подтверждено около 20 лет назад. Подсчитано, что численность клеток прокариот, присутствующих в земных недрах может достигать 25 х 1029, что потенциально составляет 40-60% всех бактерий на Земле [Whitmanetal., 1998; McMahon and Parnell, 2014]. Предел глубины, на которой возможна жизнь неизвестен, но, вероятно, он определяется температурным и водным режимом- наличием свободной воды в земной коре. Микроорганизмы были обнаружены на глубине 3.5 км в грунтовых водах, выходящих на поверхность в местах добычи золота в южноафриканских рудниках [Moser et al., 2003], в осадочных породах морского дна [Schrenk et al., 2010], и на глубине почти 4 км под ледяным покровом озера Восток . Тем не менее, учитывая масштабы «глубинной биосферы», большинство потенциальных мест обитания остаются почти полностью неисследованными [Edwards et al., 2012].
Серия широкомасштабных исследовательских вопросов остается без ответа: (1) что влияет на микробное разнообразие в подземных экосистемах [McMahon and Parnell, 2014]; (2) Каково таксономическое разнообразие этих систем [Teske and Sorensen, 2007]; (3) Какие типы микробного метаболизма используются в различных химических и физических условиях [Orsi et al., 2013]; (4) Как клетки переносят чрезвычайно низкие потоки энергии и питательных веществ, которые сильно замедляют время их удвоения и подвергают сомнению энергетические требования для поддержания жизнеспособности клетки [Hoehler and Jorgensen, 2013]; (5) Как таксономически близкие микроорганизмы появляются в, казалось бы, изолированных глубинных средах обитания по всей Земле [L'Haridon et al., 1995]; (6) Какое влияние оказывает на микроорганизмы человеческая деятельность, изменяющая подземные и океанической среды обитания. Эти вопросы подчеркивают важность продолжения исследований «глубинной биосферы» как наземных, так и морских систем.
Целью работы является получение культур сульфидогенных микроорганизмов из подземной гидротермальной скважины для изучения их физиологии, а также детекция бактериофага в культурах микроорганизмов.
Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
1. Получить устойчиво растущие накопительные культуры сульфидогенных микроорганизмов в селективных условиях;
2. Протестировать эффективность различных методов культивирования «сложнокультивируемых» микроорганизмов. Подобрать оптимальные условия для роста культур;
3. Определить физиологические характеристики новых термофильных бактерий, выделенных из подземной термальной воды глубинных скважин 1Р и 5-Р в Томской области.
4. Протестировать и подготовить наиболее перспективные культуры для молекулярной детекции бактериофага.
Работа проводилась в лаборатории биотехнологии и биоинженерии кафедры физиологии растений и биотехнологии Томского государственного университета (ТГУ).
...
Таким образом, получены накопительные культуры термофильных сульфидогенных микроорганизмов из подземной воды скважины 1-Р с использованием различных доноров электронов при температуре 50 °С. Протестирован рост культуры, растущей на формиате и представленной палочковидными клетками, с добавлением дрожжевого экстракта, дополнительных носителей и при более высокой температуре (70 °С). Выявлено, что оптимальные условия для данной культуры включают температуру 50 °С и внесение носителя (металлической губки) в культуральную жидкость объемом 120 мл. Работа с данной культурой будет продолжена для выделения чистой культуры.
Были пересеяны накопительные культуры из скв. 1-Р, с 2013 и 2014 г. хранящиеся в коллекции Лаборатории биотехнологии и биоинженерии. Выявлены наиболее перспективные культуры для молекулярной детекции бактериофагов. Культуры были подготовлены к исследованию молекулярными методами. Методом ПЦР в культурах, растущих с использованием желатина, фруктозы и пептона, обнаружены фрагменты ДНК искомого бактериофага.
В результате подбора оптимальных условий методом ПЦР с селективными праймерами, в культурах из глубинной воды скв. 1-Р были обнаружены фрагменты ДНК ранее неописанного бактериофага, детектированного в метагеноме. Для определения возможного хозяина бактериофага требуются дополнительные исследования, хотя его поливалентность также не исключена.
В ходе экспериментов с чистой культурой Thermodesulfovibrio sp. N1, выделенной из подземной воды глубинной скважины 1-Р, при различных значениях температуры и pH. Получены данные о численности клеток в диапазоне рН от 5.5 до 10.5. Определен оптимальный рН для роста микроорганизма, который составляет 9.0.
Также были проведены исследования по определению оптимума pH для культуры сульфидогенных микроорганизмов Thermodesulfovibrio sp. V2, выделенной из глубинной скважины 5-Р. Получены данные о численности клеток в диапазоне рН от 5.5 до 9.5.
