Введение 5
Глава 1. Обзор литературы 8
1.1 Эпигенетические изменения 8
1.1.2 Метилирование ДНК 9
1.1.3 МикроРНК 13
1.1.4 Модификация гистонов 15
1.2. Метилирование ДНК при раке 17
1.3 Внеклеточные ДНК 19
Глава 2. Материалы и методы исследования 23
2.1 Материалы 23
2.2 Методы исследования 23
2.2.1 Выделение ДНК 23
2.2.2 Бисульфитная модификация 24
2.2.3 Метил-специфичная полимеразная цепная реакция 26
2.2.3.1 RARB2 (retinoic acid receptor beta) 26
2.2.3.2 RASSF1A (ras association domain family member 1) 27
2.2.3.3 LINE-1 27
2.3 Статистическая обработка данных 28
ВЫВОДЫ 51
Заключение 52
Список использованной литературы
Рак легкого (РЛ) является самой распространенной формой злокачественного новообразования в мире и ведущей причиной смерти от онкологических заболеваний (1,8 случаев смерти) [8]. Тяжесть заболевания и низкая выживаемость при раке легкого связаны, прежде всего, с поздним выявлением опухоли. Следовательно, существует крайняя необходимость в разработке новых методов для прогнозирования и выявления первичной опухоли на ранних стадиях[13].
Известно, что при развитии злокачественного новообразования в клетке накапливаются различные генетические и эпигенетические изменения. Основной эпигенетической модификацией является метилирование ДНК в последовательностях цитозин-гуанин [1]. Метилирование характеризуется присоединением к цитозиновому остатку метильной группы (-CH3) с помощью деметилтрансфераз в 5-ю позицию пиримидиного кольца.
Изменение уровня метилирования является одним из ранних событий при развитии опухоли. Кроме того, опухолевые клетки характиризуются другим метиломом, в отличии от нормальных клеток.
Результаты экспериментальных работ показали, что ретротранспозоны LINE-1приобретают онкогенный потенциал в результате их гипометилирования, а гены-опухолевой супрессии RARB2и RASSF1Aв результате их гиперметилирования, что указывает на их значимость в качестве потенциальных диагностических и прогностических маркеров [3,4,18,24,26].
В составе циркулирующих ДНК (цирДНК), а также в цирДНК, связанных с поверхностью клеток крови (лейкоцитов, эритроцитов) (скп- цирДНК) могут быть выявлены фрагменты абберантно-метилированных ДНК промоторных областей генов опухолевой супрессии. Показано, что при анализе как свободно циркулирующих цирДНК, так и скп-цирДНК в крови больных раком легкого повышается чувствительность обнаружения метилированного аллеля гена [9.15.41].
На сегодняшний день отсутствуют данные относительно характера изменения уровня метилирования ретротранспозонов, генов опухолевой супрессии в цирДНК в ответ на противоопухолевое лечение. В связи с этим перспективным является исследование характера изменений уровня метилирования генов опухолевой супрессии и ретротранспозонов в составе цирДНК крови в ответ на терапию при раке легкого.
Цель работы: проведение сравнительного анализа уровня метилирования патогенетически значимых генов в составе цирДНК у больных раком легкого до и после комбинированной терапии, на этапах динамического наблюдения.
Задачи:
1. Формирование банка цирДНК из фракций крови от здоровых лиц и больных раком легкого.
2. Сбор анамнеза, подбор больных и формирование групп для исследования
3. Выбор аберрантно метилированных генов на основе анализа существующих баз данных, содержащих сведения об увеличении уровня их экспрессии в тканях опухолей легкого.
4. Сравнительный анализ уровня метилирования генов в составе циркулирующих ДНК крови здоровых доноров и больных РЛ.
5. Оценка значимости исследуемых ДНК-маркеров для определения эффективности комбинированной терапии и выявления рецидивов болезни на образцах крови, собранных в процессе динамического наблюдения.
6. Анализ данных об изменениях уровня метилирования генов в составе цирДНК в сопоставлении с патогенетически значимыми признаками и исходом заболевания для оценки прогностической значимости
В данной работе был проведен анализ уровня метилирования LINE-1 в скп-цир ДНК у больных РЛ на этапах динамического наблюдения (после 2х курсов неоадъювантной химиотерапии и последующего хирургического вмешательства.) Также был проведен эпигенетический сравнительный анализ для генов опухолевой супрессии RARB2 и RASSF1A в цирДНК и скп-цирДНК у больных НМРЛ.
Показана значимость увеличения индекса метилирования LINE-1 элементов в скп-цирДНК крови для мониторинга состояния больных РЛ после проведенного комбинированного лечения. Выявлена зависимость динамики изменения от гистологического типа опухоли: изменения циркулирующего ДНК-маркера при ПКРЛ были более значительными после завершения комбинированного лечения, тогда как при АК существенные изменения показателя индекса метилирования LINE-1 определялись на первом этапе лечения (после химиотерапии). Тренды изменений индекса метилирования LINE-1 в цирДНК оказались различны в сопоставлении уровня ответа опухоли на химиотерапию, что говорит об интегральной связи этого серологического маркера с патологическим процессом при РЛ. Полученные результаты говорят о перспективности исследования на расширенных выборках больных РЛ значимости индекса метилирования LINE-1 в цирДНК крови для прогноза ответа опухоли на лечение, оценки эффективности терапии и раннего выявления рецидивов.
Было выявлено что уровень метилирование RARB2 и RASSF1A в цирДНК плазмы и скп-цирДНК значимо выше в крови у больных с НМРЛ по сравнению со здоровыми лицами. Одновременный анализ двух фракций цирДНК позволил повысить чувствительность и специфичность анализа метилированных маркеров. Также было подтверждено, что индекс метилирования в RARB2 в скп-цирДНК связан с поздней стадией заболевания. После комбинированной терапии концентрация метилированных маркеров в крови значимо снижалась.. Индекс метилирования после частичной или полной резекции опухоли был сопоставимым с значениями ИМ для здорового контроля. Фракция скп-цирДНК характеризовалась более выраженным снижением ИМ, чем цирДНК плазмы, что подтверждает наиболее информативность данного маркера. Было выявлено повышение уровня метилированного маркера через 9 месяцев после лечения у пациентов с рецидивами. Данные показатели говорят об перспективности применения данных маркеров для мониторинга рецидивов опухоли.
