РЕФЕРАТ 4
ВВЕДЕНИЕ 5
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 6
1.1 Выделение штамма Cupriavidus eutrophus B-10646 6
1.2 Культурально-морфологические особенности штамма 6
1.3 Липиды грамотрицательных бактерий и их локализация в клетке 8
1.4 Жирные кислоты 10
1.5 Основные характеристики ПГА 12
1.6 Молекулярно-массовые показатели полимера 14
1.7 Потенциальные источники углерода для синтеза ПГА 15
1.8 Синтез ПГА 16
ГЛАВА 2. Материалы и методы 18
2.1 Объект исследования 18
2.2 Культивирование 18
2.3 Измерение параметров процесса 19
2.4 Получение липидного экстракта из Cupriavidus eutrophus B-10646 20
2.5 Приготовление метиловых эфиров жирных кислот для анализа 21
2.6 ГЖ-МС хроматография метиловых эфиров жирных кислот
экстрагируемых и прочносвязанных липидов 21
2.7 Определение качественного и количественного состава полимера
методом газо-жидкостной хроматографией с МС-детектором 22
2.8 Анализ молекулярно - массового состава полимера 23
2.9 Статистическая обработка данных 23
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 24
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 25
Наиболее перспективными продуцентами для биотехнологического производства биоразрушаемых пластиков являются водородокисляющие бактерии Cupriavidus eutrophus B-10646 (ранее Hydrogenomonas, Alcaligenes, Ralstonia, Wautersia),группа грам-отрицательных факультативных хемолитотрофных аэробных бактерий, способных накапливать полимер до 80 - 90 % на сухое вещество. Прежде всего, перспективность водородокисляющих бактерий определяется их высоким органотрофным потенциалом.
Синтез полигидроксиалканоатов (ПГА) у бактерий может быть связан с метаболизмом липидов, особенно, если в качестве субстратов используются или длинноцепочечные жирные кислоты, или растительные масла.
Бактерии Ralstonia eutrophaотносятся к наиболее изученным организмам в отношении синтеза ПГА, однако данные по составу липидов и жирных кислот весьма ограничены, несмотря на то, что липидный профиль интенсивно используется в хемотаксономии бактерий, а анализ состава жирных кислот является общепризнанным быстрым методом идентификации видов.
Жирные кислоты бактерий являются составляющими компонентами клеточных мембран, которые в первую очередь контактируют и реагируют на все изменения в окружающей среде, поддерживая взаимосвязь между структурой и функцией мембраны, сохраняя оптимальную степень текучести липидных компонентов.
Недавно было показано, что при использовании в качестве субстрата олеиновой кислоты для культивирования C. eutrophus B-10646, происходят значительные изменения в спектре жирных кислот липидов цитоплазматической мембраны. Поэтому изучение влияния различных ростовых субстратов на состав липидов этих бактерий в условиях оптимального роста и накопления ПГА представляется актуальной задачей.
Таким образом был проведен и освоен процесс культивирования бактерии C. eutrophus B-10646 в периодической культуре, исследованы урожай, выходы ПГА, общий жирнокислотный состав липидов. По результатам проведенных исследований были сформулированы следующие выводы:
1. Урожай биомассы и содержание полимера при росте на фруктозе, олеиновой кислоте и смеси фруктозы и олеиновой кислоты с добавлением валерата или пропионата калия были сопоставимы и составляли соответственно 9,3-10,2 г/л и 80-90 % от веса сухой биомассы;
2. Добавление валерата и пропионата калия привело к синтезу сополимера П(3ГБ-со-3ГВ) с включением 3ГВ соответственно 21.2-26.4 мол.% и 14.3-19.5 мол.%;
3. Средневесовая и среднечисловая молекулярная масса П(3ГБ), синтезируемого бактериями при росте на фруктозе, олеиновой кислоте и их смеси составляла соответственно 813 и 274, 775 и 220, 639 и 149 кДа. Средневесовая молекулярная масса сополимеров П(3ГБ-со-3ГВ), полученного на разных субстратах, была сопоставимой с П(3ГБ), однако полидисперсность полимера была более высокой;
4. Содержание внутриклеточных липидов не зависело от используемого субстрата и составляло около 2% от веса сухой биомассы. Жирнокислотный состав внутриклеточных липидов существенно изменялся в зависимости от используемых субстратов. Основные изменения происходили в присутствии в среде с олеиновой кислотой, повышая ее долю в липидах цитоплазматической мембраны до 50% и выше, но не зависели от пропионата и валерата калия.
