Сульфатредуцирующие бактерии в горящих отходах добычи угля
|
Аннотация 2
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 3
ВВЕДЕНИЕ 4
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7
1.1 Общая характеристика сульфатредуцирующих бактерий 7
1.2 Филогения СРБ 10
1.3 Таксономическое описание рода Desulfotomaculaceae 12
1.4 Особенности физиологии СРБ 16
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 20
2.1 Объекты исследования 20
2.1.1 Места отбора проб 20
2.1.2 Измерение скорости сульфатредукции 21
2.2 Выделение и культивирование СРБ 22
2.2.1 Приготовление основной питательной среды и добавок 22
2.2.2 Техника посевов СРБ 27
2.2.3 Получение накопительных и чистых культур 29
2.3 Световая микроскопия и трансмиссионная электронная микроскопия
(ТЭМ) 30
2.4 Изучение физиологических характеристик роста культур 31
2.5 Молекулярные методы 33
3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 35
3.1 Выделение чистой культуры спорообразующей СРБ из горящих отходов добычи угля 35
3.1.1 Выделение чистой культуры из проб горящих отвалов месторождения Бунгурский-Северный (Новокузнецк) 35
3.1.2 Выделение чистой культуры из проб горящих лигнитов
месторождения Кош-Агач (Алтай) 38
3.1.3 Физико-химическая характеристика мест отбора проб 42
3.2 Физиологические характеристики выделенных изолятов 47
3.2.1 Определение температурного диапазона для роста чистых культур 47
3.2.2 Оценка устойчивости штаммов к засолению 48
3.2.3 Изучение способности новых штаммов к утилизации различных
доноров и акцепторов электронов 49
3.2.4 Определение диапазонов pH среды при культивировании
выделенных микроорганизмов 51
ВЫВОДЫ 53
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ И ЛИТЕРАТУРЫ 54
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 3
ВВЕДЕНИЕ 4
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7
1.1 Общая характеристика сульфатредуцирующих бактерий 7
1.2 Филогения СРБ 10
1.3 Таксономическое описание рода Desulfotomaculaceae 12
1.4 Особенности физиологии СРБ 16
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 20
2.1 Объекты исследования 20
2.1.1 Места отбора проб 20
2.1.2 Измерение скорости сульфатредукции 21
2.2 Выделение и культивирование СРБ 22
2.2.1 Приготовление основной питательной среды и добавок 22
2.2.2 Техника посевов СРБ 27
2.2.3 Получение накопительных и чистых культур 29
2.3 Световая микроскопия и трансмиссионная электронная микроскопия
(ТЭМ) 30
2.4 Изучение физиологических характеристик роста культур 31
2.5 Молекулярные методы 33
3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 35
3.1 Выделение чистой культуры спорообразующей СРБ из горящих отходов добычи угля 35
3.1.1 Выделение чистой культуры из проб горящих отвалов месторождения Бунгурский-Северный (Новокузнецк) 35
3.1.2 Выделение чистой культуры из проб горящих лигнитов
месторождения Кош-Агач (Алтай) 38
3.1.3 Физико-химическая характеристика мест отбора проб 42
3.2 Физиологические характеристики выделенных изолятов 47
3.2.1 Определение температурного диапазона для роста чистых культур 47
3.2.2 Оценка устойчивости штаммов к засолению 48
3.2.3 Изучение способности новых штаммов к утилизации различных
доноров и акцепторов электронов 49
3.2.4 Определение диапазонов pH среды при культивировании
выделенных микроорганизмов 51
ВЫВОДЫ 53
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ И ЛИТЕРАТУРЫ 54
Исследования термофильных микроорганизмов, которые выживают и развиваются при экстремальных для обычной жизни температурах, расширили наше понимание о разнообразии микроорганизмов их эволюции, механизмах адаптации к условиям окружающей среды. Исследование экосистем с экстремальными условиями и факторами среды позволяет обнаружить и вывести экологически значимые штаммы [Counts et. al, 2017; Urbieta et. al., 2015.].
Большинство исследований термофильных микроорганизмов проводилось в термальных экосистемах, связанных с вулканической активностью, таких как горячие и глубоководные гидротермальные источники, или на антропогенных объектах. Помимо вулканической активности, процессы естественного горения ископаемых углеводородов и угля могут привести к образованию естественных термоэкологических ниш. Явления подземного горения угольных пластов достаточно широко распространены и находятся в Австралии, Германии, США (Пенсильвания), Китае, России, США [Stracher et. al. 2004]. Такие пожары могут длиться веками, как, например, угольный пласт в Дудвейлере (Саар, Германия), появившийся в 1668 году. Примером длительного естественного подземного горения угля является Горящая гора в Австралии [Rattigan, 1967], продолжительность горения которой, по оценкам, составляет около 6000 лет.
Обычно сгорание угля сопровождается выделением большого количества газа, который помимо CO 2 содержит водород и монооксид углерода, а также углеводороды. Эти газы могут содержать сероводород, оксиды серы и другие токсичные соединения, такие как бензол, ксилол, алифатические и галогенированные соединения [Stracher et. al. 2004; Engle et. al., 2012; Zhang et. al., 2013]. Соединения серы и другие элементы,
присутствующие в угольных пластах, могут быть вынесены на поверхность с
потоком газа, что приведёт к загрязнению соседних участков. Температура
4
угольного газа, выходящего на поверхность, зависит от температуры, при которой уголь сгорает под землёй, а температура в глубине пластов обычно колеблется в диапазоне от 50 до 800 ° C.
Экстремальные экосистемы с высокими температурами (> 50 ° C) и присутствием токсичных веществ, образовываются в местах выхода горячих угольных газов на поверхность [Tobin-Janzen et. al., 2005]. Кроме того, высокоэнергетические вещества, такие как водород и CO, содержащиеся в угольных газах, могут использоваться микроорганизмами в качестве субстратов, что определяет возможность развития специфических сообществ термофильных микроорганизмов.
В зависимости от времени возникновения подземного горения такие местообитания имеют разный возраст и представляют собой модель для изучения процессов заселения новых тепловых экосистем микроорганизмами. Однако, очень мало известно о разнообразии, составе и экологии микробных сообществ в таких экосистемах. Предварительные исследования метагеномов угольных горельников неожиданно обнаружили высокую концентрацию (до 20% сообщества) термофильных сульфатредукторов, что предполагает активный процесс сульфатредукции. Биогенная природа сероводорода в отходах добычи угля ранее не обсуждалась в литературе.
Цель данной работы: выделение и изучение сульфатредуцирующих микроорганизмов из горящих отходов добычи угля для которых характерны высокие температуры и различные значения pH.
Для достижения поставленной цели требовалось решить следующие задачи:
1. Показать протекание процесса сульфатредукции в горящих отходах добычи угля и выделить чистую культуру агента данного процесса.
2. Получить термофильные накопительные культуры и выделить чистые изоляты СРБ из образцов горящих отходов добычи угля.
3. Установить филогенетическое положение путём анализа
последовательности гена 16S рРНК для выделенных изолятов.
4. Исследовать физиологические характеристики чистых культур СРБ.
Работа проведена в Лаборатории биохимии и молекулярной биологии при кафедре физиологии растений, биотехнологии и биоинформатики Национального Исследовательского Томского государственного
университета (НИТГУ) при поддержке гранта Российского научного фонда (РНФ) № 21-14-00114.
Автор выражает благодарность научному руководителю профессору, доктору биологических наук Ольге Викторовне Карначук за научное руководство, помощь и поддержку; Инне Андреевне Пановой, Любовь Борисовне Глуховой и Анастасии Петровне Лукиной за консультации и помощь в постановке экспериментов. Д.б.н. Николаю Викторовичу Пименову (Институт микробиологии им. С. Н. Виноградского, г. Москва) за предоставление данных по измерению скорости сульфатредукции. Также, автор выражает признательность всему коллективу кафедры физиологии растений, биотехнологии и биоинформатики НИТГУ за поддержку и внимание.
Большинство исследований термофильных микроорганизмов проводилось в термальных экосистемах, связанных с вулканической активностью, таких как горячие и глубоководные гидротермальные источники, или на антропогенных объектах. Помимо вулканической активности, процессы естественного горения ископаемых углеводородов и угля могут привести к образованию естественных термоэкологических ниш. Явления подземного горения угольных пластов достаточно широко распространены и находятся в Австралии, Германии, США (Пенсильвания), Китае, России, США [Stracher et. al. 2004]. Такие пожары могут длиться веками, как, например, угольный пласт в Дудвейлере (Саар, Германия), появившийся в 1668 году. Примером длительного естественного подземного горения угля является Горящая гора в Австралии [Rattigan, 1967], продолжительность горения которой, по оценкам, составляет около 6000 лет.
Обычно сгорание угля сопровождается выделением большого количества газа, который помимо CO 2 содержит водород и монооксид углерода, а также углеводороды. Эти газы могут содержать сероводород, оксиды серы и другие токсичные соединения, такие как бензол, ксилол, алифатические и галогенированные соединения [Stracher et. al. 2004; Engle et. al., 2012; Zhang et. al., 2013]. Соединения серы и другие элементы,
присутствующие в угольных пластах, могут быть вынесены на поверхность с
потоком газа, что приведёт к загрязнению соседних участков. Температура
4
угольного газа, выходящего на поверхность, зависит от температуры, при которой уголь сгорает под землёй, а температура в глубине пластов обычно колеблется в диапазоне от 50 до 800 ° C.
Экстремальные экосистемы с высокими температурами (> 50 ° C) и присутствием токсичных веществ, образовываются в местах выхода горячих угольных газов на поверхность [Tobin-Janzen et. al., 2005]. Кроме того, высокоэнергетические вещества, такие как водород и CO, содержащиеся в угольных газах, могут использоваться микроорганизмами в качестве субстратов, что определяет возможность развития специфических сообществ термофильных микроорганизмов.
В зависимости от времени возникновения подземного горения такие местообитания имеют разный возраст и представляют собой модель для изучения процессов заселения новых тепловых экосистем микроорганизмами. Однако, очень мало известно о разнообразии, составе и экологии микробных сообществ в таких экосистемах. Предварительные исследования метагеномов угольных горельников неожиданно обнаружили высокую концентрацию (до 20% сообщества) термофильных сульфатредукторов, что предполагает активный процесс сульфатредукции. Биогенная природа сероводорода в отходах добычи угля ранее не обсуждалась в литературе.
Цель данной работы: выделение и изучение сульфатредуцирующих микроорганизмов из горящих отходов добычи угля для которых характерны высокие температуры и различные значения pH.
Для достижения поставленной цели требовалось решить следующие задачи:
1. Показать протекание процесса сульфатредукции в горящих отходах добычи угля и выделить чистую культуру агента данного процесса.
2. Получить термофильные накопительные культуры и выделить чистые изоляты СРБ из образцов горящих отходов добычи угля.
3. Установить филогенетическое положение путём анализа
последовательности гена 16S рРНК для выделенных изолятов.
4. Исследовать физиологические характеристики чистых культур СРБ.
Работа проведена в Лаборатории биохимии и молекулярной биологии при кафедре физиологии растений, биотехнологии и биоинформатики Национального Исследовательского Томского государственного
университета (НИТГУ) при поддержке гранта Российского научного фонда (РНФ) № 21-14-00114.
Автор выражает благодарность научному руководителю профессору, доктору биологических наук Ольге Викторовне Карначук за научное руководство, помощь и поддержку; Инне Андреевне Пановой, Любовь Борисовне Глуховой и Анастасии Петровне Лукиной за консультации и помощь в постановке экспериментов. Д.б.н. Николаю Викторовичу Пименову (Институт микробиологии им. С. Н. Виноградского, г. Москва) за предоставление данных по измерению скорости сульфатредукции. Также, автор выражает признательность всему коллективу кафедры физиологии растений, биотехнологии и биоинформатики НИТГУ за поддержку и внимание.
1. Отобраны пробы горящих отходов добычи угля на месторождениях Бунгурский-Северный (Новокузнецк), Кош-Агач (Республика Алтай), Черногорском (республика Хакасия) и Дальние Г оры (Киселевск, Кемеровская область), определены их физико-химические параметры. Получены накопительные культуры сульфидогенных микроорганизмов.
2. Из проб горящего отвала месторождения Бунгурский-Северный и горящего лигнита месторождения Кош-Агач выделены чистые культуры сульфатредуцирующих бактерий, обозначенные как штаммы 1066 и Al-36. Оба штамма являются термофильным бактериями, температурный диапазон роста которых составил от +55 °C до +65 °C. Оптимум для роста составляет температура +60 °C.
3. Филогенетический анализ по гену 16S рРНК показал, что оба штамма относились к роду Desulfofundulus семейства Desulfotomaculaceae.
4. Изучены физиологические характеристики штаммов 1066 и Al-36. Донорами электронов, обеспечивающими максимальный рост и сульфатредукцию, являются пируват и лактат. Кроме сульфата штаммы способны использовать тиосульфат и сульфит в качестве акцепторов электронов. Способности к восстановлению нитратов и нитритов не обнаружено.
5. Штаммы 1066 и Al-36 способны расту при низком содержании NaCl в среде в диапазоне от 0 до 1 %. Диапазон для роста изменялся от 6.5 до 7.5.
2. Из проб горящего отвала месторождения Бунгурский-Северный и горящего лигнита месторождения Кош-Агач выделены чистые культуры сульфатредуцирующих бактерий, обозначенные как штаммы 1066 и Al-36. Оба штамма являются термофильным бактериями, температурный диапазон роста которых составил от +55 °C до +65 °C. Оптимум для роста составляет температура +60 °C.
3. Филогенетический анализ по гену 16S рРНК показал, что оба штамма относились к роду Desulfofundulus семейства Desulfotomaculaceae.
4. Изучены физиологические характеристики штаммов 1066 и Al-36. Донорами электронов, обеспечивающими максимальный рост и сульфатредукцию, являются пируват и лактат. Кроме сульфата штаммы способны использовать тиосульфат и сульфит в качестве акцепторов электронов. Способности к восстановлению нитратов и нитритов не обнаружено.
5. Штаммы 1066 и Al-36 способны расту при низком содержании NaCl в среде в диапазоне от 0 до 1 %. Диапазон для роста изменялся от 6.5 до 7.5.
