РАЗРАБОТКА И ВАЛИДАЦИЯ БИОАНАЛИТИЧЕСКОЙ МЕТОДИКИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДЕЙСТВУЮЩЕГО ВЕЩЕСТВА ИНДОМЕНТИЛА И ЕГО МЕТАБОЛИТА В ПЛАЗМЕ КРОВИ МЕТОДОМ ВЭЖХ
|
Аннотация 3
Список обозначений и сокращений 5
Введение 6
1 Нестероидные противовоспалительные препараты 8
1.1 Механизм действия НИВИ 9
1.2 Патофизиология, вызываемая приёмом НИВИ 10
1.3 Современные методы терапии для снижения токсичного действия НИВИ и
профилактики повреждения ЖКТ 10
1.3.1 Иролекарства 10
1.3.2 Эфиры НИВИ 11
2 Значимость и актуальность исследования работы 13
3 Описание объекта исследования 15
4 Физико-химические методы, использующиеся при анализе лекарственных средств ...19
4.1 Высокоэффективная жидкостная хроматография 19
4.1.1 Неподвижные фазы 19
4.1.2 Хроматографические колонки 21
4.1.3 Подвижные фазы 23
4.1.4 Детектирование лекарственных веществ в ОФ ВЭЖХ 26
4.2 Газовая хроматография с масс-спектрометрическим детектированием 28
5 Подготовка пробы 32
6 Экспериментальная часть 37
Разработка и валидация методики определения действующего вещества в биологических средах 37
6.1 Разработка методики определения ИМЛ в биологических средах 37
6.1.1 Подбор хроматографических условий 37
6.1.2 Иодбор условий извлечения определяемого вещества 38
6.2 Валидация биоаналитической методики количественного определения ИМЛ и его
метаболита в плазме крови крыс методом ВЭЖХ 40
6.2.1 Материалы и методы 40
6.2.2 Ириготовление растворов 42
6.2.2.1 Ириготовление подвижной фазы (элюента) для ВЭЖХ 42
6.2.2.2 Ириготовление исходного раствора субстанции ИМЛ и индометацина 43
6.2.2.3 Ириготовление калибровочных растворов ИМЛ и индометацина Error!
Bookmark not defined.
6.2.3 Аналитическая методика 43
6.2.3.1 Пробоподготовка 43
6.2.3.2 Хроматографические условия 44
6.2.4 Результаты валидационных тестов 44
6.2.4.1 Селективность 44
6.2.4.2 Перенос 47
6.2.4.3 Нижний предел количественного определения 49
6.2.4.4 Калибровочная кривая 50
6.2.4.5 Точность 59
Точность внутри цикла 59
Точность между циклами 62
6.2.4.6 Прецизионность 69
Прецизионность внутри цикла 69
Прецизионность между циклами 70
Заключение 73
Список литературы 74
Приложения 80
Приложение 1. Валидация биоаналитической методики 80
Список обозначений и сокращений 5
Введение 6
1 Нестероидные противовоспалительные препараты 8
1.1 Механизм действия НИВИ 9
1.2 Патофизиология, вызываемая приёмом НИВИ 10
1.3 Современные методы терапии для снижения токсичного действия НИВИ и
профилактики повреждения ЖКТ 10
1.3.1 Иролекарства 10
1.3.2 Эфиры НИВИ 11
2 Значимость и актуальность исследования работы 13
3 Описание объекта исследования 15
4 Физико-химические методы, использующиеся при анализе лекарственных средств ...19
4.1 Высокоэффективная жидкостная хроматография 19
4.1.1 Неподвижные фазы 19
4.1.2 Хроматографические колонки 21
4.1.3 Подвижные фазы 23
4.1.4 Детектирование лекарственных веществ в ОФ ВЭЖХ 26
4.2 Газовая хроматография с масс-спектрометрическим детектированием 28
5 Подготовка пробы 32
6 Экспериментальная часть 37
Разработка и валидация методики определения действующего вещества в биологических средах 37
6.1 Разработка методики определения ИМЛ в биологических средах 37
6.1.1 Подбор хроматографических условий 37
6.1.2 Иодбор условий извлечения определяемого вещества 38
6.2 Валидация биоаналитической методики количественного определения ИМЛ и его
метаболита в плазме крови крыс методом ВЭЖХ 40
6.2.1 Материалы и методы 40
6.2.2 Ириготовление растворов 42
6.2.2.1 Ириготовление подвижной фазы (элюента) для ВЭЖХ 42
6.2.2.2 Ириготовление исходного раствора субстанции ИМЛ и индометацина 43
6.2.2.3 Ириготовление калибровочных растворов ИМЛ и индометацина Error!
Bookmark not defined.
6.2.3 Аналитическая методика 43
6.2.3.1 Пробоподготовка 43
6.2.3.2 Хроматографические условия 44
6.2.4 Результаты валидационных тестов 44
6.2.4.1 Селективность 44
6.2.4.2 Перенос 47
6.2.4.3 Нижний предел количественного определения 49
6.2.4.4 Калибровочная кривая 50
6.2.4.5 Точность 59
Точность внутри цикла 59
Точность между циклами 62
6.2.4.6 Прецизионность 69
Прецизионность внутри цикла 69
Прецизионность между циклами 70
Заключение 73
Список литературы 74
Приложения 80
Приложение 1. Валидация биоаналитической методики 80
В современном мире достаточно большое внимание уделяется сфере здравоохранения. Множество великих умов борются с проблемами, касающимися здоровья современного человека, такими, как различные виды рака, СПИД, нарушения, связанные с опорно-двигательными процессами и многое другое. К тому же с каждым годом все большее влияние на здоровье оказывают ухудшение экологии, изменение климата и стрессовые состояния. Поэтому забота о здоровье касается каждого без исключения, и всегда здорово слышать новости о победе над, казалось бы, непобедимым недугом, тревога о котором с этого момента остается в прошлом.
Тем не менее, исследование заболеваний различного рода требует особых усилий, ведь нужно разобраться в причинах появления инфекции, установить возможные методы устранения определенного заболевания. Это значит, что без испытаний лекарственных средств не обойтись, так как требуется гарантия того, что данный препарат способен справиться с поставленной задачей в полной мере. Для этого, кроме медицины и биологии имеется необходимость в химии, так как различные фармацевтические субстанции нарабатываются при помощи органического синтеза, а также методы аналитической химии могут показать работоспособность нового перспективного препарата.
Лечение воспалительных и дегенеративных заболеваний опорно-двигательного аппарата является актуальной проблемой современной медицины. Более 10 % населения страдают от хронических болей и воспалительных процессов, связанных с артритами, около 7 % страдают остеоартрозом. Для лечения таких заболеваний широко используются нестероидные противовоспалительные препараты, которые обладают серьезными побочными эффектами: почти у 60 % больных они могут вызывать поражение органов желудочно-кишечного тракта, а также другие опасные побочные эффекты.
Для повышения безопасности и эффективности фармакотерапии артритов в мире имеется ряд подходов, в частности многие научные центры и фармацевтические компании работают над созданием низкотоксичных производных и/или новых формуляций известных НПВП. Одним из наиболее эффективных и перспективных решений в этой области является создание лекарственного препарата - пролекарства на основе новой малотоксичной молекулы - производного индолуксусной кислоты (ментилового эфира индометацина) и специальной лекарственной формы, обеспечивающей целевую доставку активного вещества в зону воспаления и минимизацию системных токсических эффектов. В результате имеется высокая эффективность и безопасность терапии артритов и других воспалительных заболеваний в сравнении с известными НПВП.
Разрабатываемый препарат является инновационным решением в области противовоспалительной терапии и не имеет прямых мировых аналогов. Благодаря реализации комбинации двух современных подходов к разработке новых лекарственных средств (синтез новой молекулы - пролекарства, создание новой системы доставки) новый препарат будет отличаться от существующих НПВП рядом полезных потребительских свойств:
- минимизацией или отсутствием опасных побочных эффектов в отношении органов ЖКТ (образование эрозий, язв, смертельно опасные желудочно-кишечные кровотечения);
- минимизацией (предполагаемой) других системных побочных токсических эффектов в отношении почек, печени, сердечно-сосудистой системы;
- высокой эффективностью действия (высокой противовоспалительной и анальгетической активностью) при длительном применении;
- пролонгированным высвобождением (возможностью достижения стабильной концентрации активного компонента в плазме крови после однократного перорального введения).
Основная область применения нового препарата - лечение артритов (ревматоидного артрита, подагрического артрита) и других острых и хронических воспалительных и дегенеративных заболеваний опорно-двигательного аппарата.
Целью настоящей работы является разработка и валидация биоаналитической методики определения действующего вещества - индоментила и его основного метаболита индометацина в плазме крови методом ВЭЖХ.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
1. Проведение анализа литературных источников;
2. Изучение влияния факторов, влияющих на аналитический сигнал в ВЭЖХ: природа носителя, длина волны, ионная сила;
3. Проведение оптимизации процесса подготовки образца к выполнению измерений: подбор экстрагента, времени экстрагирования;
4. Проведение валидации биоаналитической методики по следующим тестам: селективность, нижний предел количественного определения, калибровочная кривая, перенос, точность и прецизионность.
Исследование проводилось на базе лаборатории аналитической химии отдела фармацевтических разработок предприятия ООО «Инновационные Фармакологические Разработки», генеральным директором которого является фармаколог, доктор медицинских наук профессор Хазанов Вениамин Абрамович.
Тем не менее, исследование заболеваний различного рода требует особых усилий, ведь нужно разобраться в причинах появления инфекции, установить возможные методы устранения определенного заболевания. Это значит, что без испытаний лекарственных средств не обойтись, так как требуется гарантия того, что данный препарат способен справиться с поставленной задачей в полной мере. Для этого, кроме медицины и биологии имеется необходимость в химии, так как различные фармацевтические субстанции нарабатываются при помощи органического синтеза, а также методы аналитической химии могут показать работоспособность нового перспективного препарата.
Лечение воспалительных и дегенеративных заболеваний опорно-двигательного аппарата является актуальной проблемой современной медицины. Более 10 % населения страдают от хронических болей и воспалительных процессов, связанных с артритами, около 7 % страдают остеоартрозом. Для лечения таких заболеваний широко используются нестероидные противовоспалительные препараты, которые обладают серьезными побочными эффектами: почти у 60 % больных они могут вызывать поражение органов желудочно-кишечного тракта, а также другие опасные побочные эффекты.
Для повышения безопасности и эффективности фармакотерапии артритов в мире имеется ряд подходов, в частности многие научные центры и фармацевтические компании работают над созданием низкотоксичных производных и/или новых формуляций известных НПВП. Одним из наиболее эффективных и перспективных решений в этой области является создание лекарственного препарата - пролекарства на основе новой малотоксичной молекулы - производного индолуксусной кислоты (ментилового эфира индометацина) и специальной лекарственной формы, обеспечивающей целевую доставку активного вещества в зону воспаления и минимизацию системных токсических эффектов. В результате имеется высокая эффективность и безопасность терапии артритов и других воспалительных заболеваний в сравнении с известными НПВП.
Разрабатываемый препарат является инновационным решением в области противовоспалительной терапии и не имеет прямых мировых аналогов. Благодаря реализации комбинации двух современных подходов к разработке новых лекарственных средств (синтез новой молекулы - пролекарства, создание новой системы доставки) новый препарат будет отличаться от существующих НПВП рядом полезных потребительских свойств:
- минимизацией или отсутствием опасных побочных эффектов в отношении органов ЖКТ (образование эрозий, язв, смертельно опасные желудочно-кишечные кровотечения);
- минимизацией (предполагаемой) других системных побочных токсических эффектов в отношении почек, печени, сердечно-сосудистой системы;
- высокой эффективностью действия (высокой противовоспалительной и анальгетической активностью) при длительном применении;
- пролонгированным высвобождением (возможностью достижения стабильной концентрации активного компонента в плазме крови после однократного перорального введения).
Основная область применения нового препарата - лечение артритов (ревматоидного артрита, подагрического артрита) и других острых и хронических воспалительных и дегенеративных заболеваний опорно-двигательного аппарата.
Целью настоящей работы является разработка и валидация биоаналитической методики определения действующего вещества - индоментила и его основного метаболита индометацина в плазме крови методом ВЭЖХ.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
1. Проведение анализа литературных источников;
2. Изучение влияния факторов, влияющих на аналитический сигнал в ВЭЖХ: природа носителя, длина волны, ионная сила;
3. Проведение оптимизации процесса подготовки образца к выполнению измерений: подбор экстрагента, времени экстрагирования;
4. Проведение валидации биоаналитической методики по следующим тестам: селективность, нижний предел количественного определения, калибровочная кривая, перенос, точность и прецизионность.
Исследование проводилось на базе лаборатории аналитической химии отдела фармацевтических разработок предприятия ООО «Инновационные Фармакологические Разработки», генеральным директором которого является фармаколог, доктор медицинских наук профессор Хазанов Вениамин Абрамович.
Таким образом, в ходе проведенных исследований решены следующие задачи:
1. Разработана новая биоаналитическая методика количественного определения ИМЛ в плазме крови методом ВЭЖХ с УФ-детектированием. В ходе исследования подобрана основная аналитическая длина волны, имеющая значение 320 нм, установлено общее время проведения анализа - 20 мин, разработаны состав подвижной фазы, соотношение растворителей для градиентного режима элюирования, скорости потока, длины волны детектирования.
2. Проведена оптимизация процесса подготовки для извлечения аналита из биологической матрицы путем жидкостно-жидкостной экстракции ацетонитрилом по принципу QuEChERS.
3. Успешно выполнена валидация биоаналитической методики количественного определения ИМЛ в плазме крови крыс методом ВЭЖХ с УФ-детектированием. В ходе валидации доказано отсутствие отклонений от установленных критериев приемлемости. Результаты всех валидационных тестов полностью соответствуют критериям приемлемости. По результатам проведенных испытаний биоаналитической методике количественного определения ИМЛ и его метаболита в плазме крови крыс методом ВЭЖХ присвоен статус «ВАЛИДИРОВАНО».
Бионалитическая методика может быть использована для количественного определения ИМЛ в плазме крови крыс методом ВЭЖХ в различных фармакокинетических исследованиях.
1. Разработана новая биоаналитическая методика количественного определения ИМЛ в плазме крови методом ВЭЖХ с УФ-детектированием. В ходе исследования подобрана основная аналитическая длина волны, имеющая значение 320 нм, установлено общее время проведения анализа - 20 мин, разработаны состав подвижной фазы, соотношение растворителей для градиентного режима элюирования, скорости потока, длины волны детектирования.
2. Проведена оптимизация процесса подготовки для извлечения аналита из биологической матрицы путем жидкостно-жидкостной экстракции ацетонитрилом по принципу QuEChERS.
3. Успешно выполнена валидация биоаналитической методики количественного определения ИМЛ в плазме крови крыс методом ВЭЖХ с УФ-детектированием. В ходе валидации доказано отсутствие отклонений от установленных критериев приемлемости. Результаты всех валидационных тестов полностью соответствуют критериям приемлемости. По результатам проведенных испытаний биоаналитической методике количественного определения ИМЛ и его метаболита в плазме крови крыс методом ВЭЖХ присвоен статус «ВАЛИДИРОВАНО».
Бионалитическая методика может быть использована для количественного определения ИМЛ в плазме крови крыс методом ВЭЖХ в различных фармакокинетических исследованиях.
