Аннотация
ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, СИМВОЛОВ, СОКРАЩЕНИЙ,
ТЕРМИНОВ 5
ВВЕДЕНИЕ 7
1 Обзор литературы 9
1.1 Макрофаги и их роль в регенерации 9
1.1.1 Основные функции макрофагов 9
1.1.2 Поляризация макрофагов 11
1.1.3 Факторы, влияющие на поляризацию макрофагов 16
1.2 Мезенхимальные стволовые клетки и их роль в регенерации 17
1.2.1 Морфофункциональные характеристики 17
1.2.2 Дифференцировочный потенциал и регуляторные функции 19
1.2.3 Совместная роль МСК и макрофагов в регенерации тканей 20
1.3 Скаффолды в тканевой инженерии 21
1.3.1. Создание необходимого окружения для регенерации тканей 21
1.3.2 Требования к скаффолдам 21
1.3.3 Виды скаффолдов 22
1.4 Поли-Е-лактид (PLLA) как основа скаффолдов 25
1.4.1 Химическая структура и свойства PLA 25
1.4.2 Использование PLLA в медицине 27
1.4.3 Пьезоэлектические свойства 28
1.5 Магниточувствительные скаффолды 29
1.5.1 Магнитные наночастицы железа 29
1.5.2 Синтез PLLA-скаффолдов с включением магнитных компонентов 30
1.5.3 Влияние магнитного поля на клетки in vitro 31
1.5.4 Биологическое влияние магнитных скаффолдов на клетки 32
2 Материалы и методы 34
2.1 Материалы 34
2.1.1 Магниточувствительные скаффолды 34
2.1.2 Клеточные линии 34
2.1.3 Реактивы и расходные материалы 34
2.2 Методы 35
2.2.1 Подготовка скаффолдов для клеточных исследований 35
2.2.2 Порядок работы с мезенхимальными стволовыми клетками 35
2.2.2.1 Выделение МСК из липоаспирата человека 35
2.2.2.2 Культивирование МСК 36
2.2.2.3 Окрашивание антителами и проточно-цитометрический анализ 37
2.2.2.4 Оценка жизнеспособности клеток на скаффолдах и бесконтактный метод
определения токсичности скаффолдов 38
2.2.2.5 Исследование жизнеспособности методом Alamar Вйю 38
2.2.2.6 Исследование адгезии МСК на скаффолдах методом флуоресцентной
микроскопии 39
2.2.2.7 Анализ остеогенной дифференцировки МСК человека на скаффолдах под
действием переменного магнитного поля 39
2.2.2.8 Определение активности щелочной фосфатазы (ЩФ) 41
2.2.2.9 Количественное определение белка методом BCA 42
2.2.2.10 Окрашивание ализариновым красным 42
2.2.3 Порядок работы с моноцитами и макрофагами человека 43
2.2.3.1 Выделение моноцитов из лейкотромбослоя методом магнитного сортинга .43
2.2.3.2 Дифференцировка моноцитов в макрофаги 44
2.2.3.3 Иммуноцитофлуоресцентное окрашивание макрофагов 45
2.2.3.4 Воздействие переменного магнитного поля на дифференцировку
макрофагов 47
2.2.4 Статистический анализ данных 48
3 Результаты и обсуждение 49
3.1 Мезенхимальные стволовые клетки человека 49
3.1.1 Характеризация полученной клеточной культуры методом проточной
цитометрии 49
3.1.2 Исследование цитотоксичности скаффолдов 51
3.1.3 Влияние переменного магнитного поля на дифференцировку МСК 53
3.2 Макрофаги человека 57
3.2.1 Дифференцирование моноцитов в макрофаги in vitro 57
3.2.2 Исследование жизнеспособности и фенотипа макрофагов на магнитных
скаффолдах при воздействии переменного магнитного поля 63
3.3 Обсуждение результатов 66
ВЫВОДЫ 69
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 70
Регенерация повреждённых тканей остаётся одной из ключевых задач современной биомедицины и тканевой инженерии. При разработке имплантируемых конструкций особое внимание уделяется созданию биосовместимых материалов, способных не только обеспечивать структурную поддержку, но и активно модулировать поведение клеток в зоне повреждения. Одним из перспективных подходов регенеративной медицины является использование скаффолдов, имитирующих внеклеточный матрикс и формирующих подходящую микросреду для восстановления тканей.
Макрофаги играют центральную роль в координации процессов воспаления, заживления и регенерации, обладая способностью к поляризации в про- и
противовоспалительные фенотипы [The Role of Macrophages ..., 2018]. Их
функциональное состояние определяет направление и эффективность тканевого
восстановления. Наряду с макрофагами, мезенхимальные стволовые клетки (МСК) активно вовлечены в регенеративные процессы за счёт мультипотентности, иммуномодуляторной активности и способности к секреции биологически активных факторов [Mesenchymal stem cell perspective ..., 2019]. Взаимодействие МСК и макрофагов формирует сложную сигнальную сеть, определяющую исход регенерации [Interplay between ..., 2024].
Одним из наиболее широко применяемых материалов для создания скаффолдов является поли-й-лактид (PLLA), обладающий биосовместимостью, биоразлагаемостью и механической прочностью [Degradation mechanisms ..., 2021]. Однако ограниченная биологическая активность PLLA побуждает исследований к его модификации, в том числе за счёт введения функциональных добавок. В частности, интеграция магнитных наночастиц, таких как наночастицы оксида железа (РезСД позволяет придавать материалу чувствительность к внешнему магнитному полю [Fe3O4 Nanoparticles ..., 2021]. Это открывает возможности для направленной стимуляции клеток и регуляции их поведения без прямого контакта за счет наложения внешнего магнитного поля.
Использование магниточувствительных скаффолдов представляет собой активно развивающееся направление. Подобные скаффолды могут обеспечить структурные и функциональные преимущества, что делает перспективным их использование при восстановлении костной ткани. Исследование влияния магниточувствительных скаффолдов на жизнеспособность, дифференцировку МСК и поляризацию макрофагов представляет научный и практический интерес в контексте разработки управляемых биоматериалов нового поколения.
Цель исследования - изучить взаимодействие скаффолдов на основе поли-L- лактида, в том числе содержащих в своей структуре магнитные наночастицы БезО4, с мезенхимальными стволовыми клетками и макрофагами человека в условиях in vitro. Задачи:
1. Изучить биосовместимость скаффолдов по отношению к мезенхимальным стволовым клеткам и макрофагам человека.
2. Оценить адгезию мезенхимальных стволовых клеток и макрофагов на поверхности скаффолдов.
3. Изучить влияние переменного магнитного поля на функциональную активность мезенхимальных стволовых клеток, адгезированных на скаффолдах.
4. Оценить влияние переменного магнитного поля на фенотип макрофагов, адгезированных на скаффолдах.
Работа была выполнена в Центральной научно-исследовательской лаборатории Сибирского государственного медицинского университета под руководством доцента кафедры генетики и клеточной биологии, заведующего центром Биологических исследований и биоинженерии ЦНИЛ СибГМУ Першиной Александры Геннадьевны.
1. Макрофаги и мезенхимальные стволовые клетки человека адгезируют на поверхности скаффолдов на основе поли-Ь-лактида; введение магнитных наночастиц в структуру скаффолдов не влияет на эффективность адгезии макрофагов и мезенхимальных стволовых клеток человека.
2. Магниточувствительные скаффолды на основе поли-Ь-лактида, содержащие магнитные наночастицы оксида железа, не оказывают цитотоксического действия на макрофаги и мезенхимальные стволовые клетки человека.
3. Воздействие переменного магнитного поля с параметрами 10 мТл, 10 Гц не оказывает цитотоксического действия на мезенхимальные стволовые клетки человека, адгезированные на магниточувствительных скаффолдах на основе поли-Ь-лактида.
4. Воздействие переменного магнитного поля с параметрами 10-100 мТл, 10-45 Гц в процессе дифференцировки CD14+ моноцитов периферической крови человека в макрофаги на магниточувствительных скаффолдах на основе поли-Ь-лактида усиливает экспрессию CD163.
