Связь профиля метилирования ретротранспозона LINE-1 в различных компартментах бластоцист, внеклеточной ДНК внутриполостной жидкости, сред для культивирования эмбриона с морфологическими характеристиками бластоцист
|
Аннотация 1
Список использованных сокращений 8
Введение 9
1 Обзор литературы 12
1.1 Стадии развития эмбриона в зародышевый период 12
1.2 Внеклеточная ДНК во внутриполостной жидкости бластоцисты и среде для
культивирования эмбриона 16
1.3 Числовые хромосомные нарушения в эмбриогенезе 18
1.3.1 Частота и роль анеуплоидии в эмбриогенезе 19
1.3.2 Использование различных методов биопсии эмбриона для преимплантационного
генетического тестирования 21
1.3.2.1 Биопсия полярных телец 22
1.3.2.2 Биопсия бластомеров на стадии дробления 23
1.3.2.3 Биопсия эмбрионов на стадии морулы 24
1.3.2.4 Биопсия клеток трофэктодермы 24
1.3.2.5 Аспирация жидкости из полости бластоцисты (бластоцентез) и среды для
культивирования эмбриона 25
1.4 Нарушения метилирования ДНК в эмбриогенезе 28
1.4.1 Метилирование ДНК 29
1.4.2 Установление метилирования в половых клетках, зиготе и последующих этапах
развития 33
1.4.3 Роль аномалий метилирования генома в эмбриогенезе 36
1.4.4 Потенциальное место измерения метилирования в качестве преимплантационной
генетической диагностики 38
2 Материалы и методы 41
2.1 Материалы 41
2.2 Методы 41
2.2.1 Забор внутриполостной жидкости бластоцист 41
2.2.2 Забор внутренней клеточной массы и клеток трофэктодермы 42
2.2.3 Лизис внеклеточной ДНК из внутриполостной жидкости бластоцист и образцов сред
для культивирования 42
2.2.4 Лизис клеток внутренней клеточной массы и клеток трофэктодермы 42
2.2.5 Бисульфитная конверсия 42
2.2.6 Получение ДНК-библиотек. Первый этап ПЦР для амплификации фрагмента промотора ретротранспозона LINE-1 43
2.2.8 Чистка ПЦР продукта с помощью магнитных шариков AMPure 44
2.2.9 Тупление концов целевых фрагментов полученной ДНК-библиотеки 44
2.2.10 Секвенирование полученных ДНК-библиотек и биоинформатическая обработка ...45
3 Результаты и обсуждение 46
Выводы 60
Список использованной литературы 61
Список использованных сокращений 8
Введение 9
1 Обзор литературы 12
1.1 Стадии развития эмбриона в зародышевый период 12
1.2 Внеклеточная ДНК во внутриполостной жидкости бластоцисты и среде для
культивирования эмбриона 16
1.3 Числовые хромосомные нарушения в эмбриогенезе 18
1.3.1 Частота и роль анеуплоидии в эмбриогенезе 19
1.3.2 Использование различных методов биопсии эмбриона для преимплантационного
генетического тестирования 21
1.3.2.1 Биопсия полярных телец 22
1.3.2.2 Биопсия бластомеров на стадии дробления 23
1.3.2.3 Биопсия эмбрионов на стадии морулы 24
1.3.2.4 Биопсия клеток трофэктодермы 24
1.3.2.5 Аспирация жидкости из полости бластоцисты (бластоцентез) и среды для
культивирования эмбриона 25
1.4 Нарушения метилирования ДНК в эмбриогенезе 28
1.4.1 Метилирование ДНК 29
1.4.2 Установление метилирования в половых клетках, зиготе и последующих этапах
развития 33
1.4.3 Роль аномалий метилирования генома в эмбриогенезе 36
1.4.4 Потенциальное место измерения метилирования в качестве преимплантационной
генетической диагностики 38
2 Материалы и методы 41
2.1 Материалы 41
2.2 Методы 41
2.2.1 Забор внутриполостной жидкости бластоцист 41
2.2.2 Забор внутренней клеточной массы и клеток трофэктодермы 42
2.2.3 Лизис внеклеточной ДНК из внутриполостной жидкости бластоцист и образцов сред
для культивирования 42
2.2.4 Лизис клеток внутренней клеточной массы и клеток трофэктодермы 42
2.2.5 Бисульфитная конверсия 42
2.2.6 Получение ДНК-библиотек. Первый этап ПЦР для амплификации фрагмента промотора ретротранспозона LINE-1 43
2.2.8 Чистка ПЦР продукта с помощью магнитных шариков AMPure 44
2.2.9 Тупление концов целевых фрагментов полученной ДНК-библиотеки 44
2.2.10 Секвенирование полученных ДНК-библиотек и биоинформатическая обработка ...45
3 Результаты и обсуждение 46
Выводы 60
Список использованной литературы 61
Репродуктивные потери у человека являются крайне частым событием. Если потеря плода происходит до 20 недель гестации, то такое явление принято считать спонтанным абортом. По данным демографических исследований только 25 % женщин среднего репродуктивного возраста способны произвести жизнеспобоное потомство [Edmonds et al., 1982]. При этом около 15 % беременностей завершаются спонтанным прерыванием первом триместре [Carr et al., 1983]. Смерть эмбрионов в раннем возрасте - это одно из самых серьезных следствий генетических нарушений, причем самыми распространенными из них являются аномалии числа хромосом, такие как анеуплоидия. Обычно от 50 до 60 процентов случаев прерывания беременности в первом триместре связаны с аномалиями числа хромосом, известными как анеуплоидии, которые могут затронуть различные хромосомы. [Eiben et al., 1990; Menasha et al., 2005; Баранов, Кузнецова, 2007].
В последние годы в литературе появляется все больше сведений о значительном влиянии изменения профиля метилирования ДНК на возникновение анеуплоидии. Предполагается, что снижение уровня глобального метилирования генома оказывает влияние на частоту возникновения числовых хромосомных аберраций вследствие гипометилирования цитозина в центромерных и прицентромерных участках хромосом, которое, в свою очередь, приводит к изменению конформации прицентромерного хроматина, нарушениям прикрепления микротрубочек веретена деления к хромосомам и, в конечном итоге, к неправильной сегрегации хромосом и анеуплоидии [Schueler et al., 2006]. В наших предварительных исследованиях показаны масштабные нарушения метилома в хорионе спонтанных абортусов первого триместра как с анеуплоидным, так и с нормальным кариотипом [Vasilyev et al., 2021; Tolmacheva et al., 2022], ведущими из которых являются нарушения метилирования генов морфогенеза плаценты и генов ремоделирования спиральных артерий. Это может объяснять гибель большей части эмбрионов в период первого триместра, когда происходит ремоделирование спиральных артерий матки, благодаря которому обеспечивается дальнейший быстрый рост и развитие эмбриона.
Одним из актуальных вопросов является установление времени возникновения и причин масштабных аномалий метилирования у спонтанных абортусов первого триместра беременности. Результаты недавних исследований показывают, что нарушения метилирования, связанные с гибелью эмбриона, отмечаются уже в ооцитах при оплодотворении [Yuan et al., 2021] и в эмбрионах на стадии дробления [Arand et al., 2021]. Эти наблюдения свидетельствуют в пользу гипотезы о возникновении аномалий метилома на одной из более ранних стадий эпигенетического репрограммирования: при установлении метилирования, специфичного для половых клеток в мейозе, или даже раньше - при масштабном деметилировании генома на стадии примордиальных клеток. Это же подтверждают и наши исследования, в которых нарушения метилирования ретротранспозона LINE-1 наблюдались как у эмбрионов с анеуплоидией, так и у части эмбрионов с нормальным кариотипом [Vasilyev et al., 2021], что может быть следствием возникновения аномалий метилирования еще до возникновения анеуплоидии в мейозе.
Возникновение аномалий метилома в гаметогенезе и их связь с различными осложнениями беременности открывает возможности к использованию эпигенетических маркеров для прогнозирования вероятности рождения здорового ребенка. Возможными вариантами для такого тестирования в клинической практике может стать либо малоинвазивное пренатальное тестирование, либо преимплантационное тестирование при использовании вспомогательных репродуктивных технологий. Ключевым вопросом является возможность получения биологического материала от эмбриона для проведения такого тестирования. Таким материалом могут стать отдельные бластомеры, клетки трофэктодермы, жидкость из полости бластоцисты или образцы сред для культивирования эмбриона [Galluzzi et al., 2015]. В последних исследованиях было показано, что повышенный уровень метилирования генома в полярных тельцах и отдельных бластомерах связан с аномальным развитием эмбриона. Однако в настоящее время проведение новых перспективных исследований в этом направлении затруднено в связи с общемировым отказом от проведения преимплантационного тестирования на полярных тельцах и отдельных бластомерах и общим стремлением к снижению инвазивности процедур тестирования. В этой связи наиболее перспективным направлением является использование для тестирования внеклеточной ДНК из жидкости полости бластоцисты или культуральных сред. Процедура получения данного материала является малоинвазивной и может быть встроена в стандартные протоколы подготовки бластоцист к замораживанию.
Таким образом целью данного исследования является установление профиля метилирования в различных компартментах бластоцисты таких как трофэктодерма, внутренняя клеточная масса, внеклеточная ДНК из внутриполостной жидкости бластоцисты и сред для культивирования эмбриона и связь профиля метилирования с морфологическими характеристиками бластоцист.
В связи с целью были поставлены следующие задачи:
1) Провести анализ нарушения метилирования ретротрапспозона LINE-1 у
эмбрионов человека на стадии бластоцисты;
2) Провести сравнительный анализ уровня метилирования ретротранспозона LINE-1 в различных компартментах бластоцист и во внеклеточной ДНК внутриполостной жидкости и сред для культивирования;
3) Определить связь выявленных нарушений метилирования ретротранспозона LINE-1 с морфологическими изменениями в бластоцистах.
Работа проводилась на базе лаборатории инструментальной геномики НИИ медицинской генетики Томского национального исследовательского медицинского центра под руководством доктора биологических наук Васильева Станислава Анатольевича.
В последние годы в литературе появляется все больше сведений о значительном влиянии изменения профиля метилирования ДНК на возникновение анеуплоидии. Предполагается, что снижение уровня глобального метилирования генома оказывает влияние на частоту возникновения числовых хромосомных аберраций вследствие гипометилирования цитозина в центромерных и прицентромерных участках хромосом, которое, в свою очередь, приводит к изменению конформации прицентромерного хроматина, нарушениям прикрепления микротрубочек веретена деления к хромосомам и, в конечном итоге, к неправильной сегрегации хромосом и анеуплоидии [Schueler et al., 2006]. В наших предварительных исследованиях показаны масштабные нарушения метилома в хорионе спонтанных абортусов первого триместра как с анеуплоидным, так и с нормальным кариотипом [Vasilyev et al., 2021; Tolmacheva et al., 2022], ведущими из которых являются нарушения метилирования генов морфогенеза плаценты и генов ремоделирования спиральных артерий. Это может объяснять гибель большей части эмбрионов в период первого триместра, когда происходит ремоделирование спиральных артерий матки, благодаря которому обеспечивается дальнейший быстрый рост и развитие эмбриона.
Одним из актуальных вопросов является установление времени возникновения и причин масштабных аномалий метилирования у спонтанных абортусов первого триместра беременности. Результаты недавних исследований показывают, что нарушения метилирования, связанные с гибелью эмбриона, отмечаются уже в ооцитах при оплодотворении [Yuan et al., 2021] и в эмбрионах на стадии дробления [Arand et al., 2021]. Эти наблюдения свидетельствуют в пользу гипотезы о возникновении аномалий метилома на одной из более ранних стадий эпигенетического репрограммирования: при установлении метилирования, специфичного для половых клеток в мейозе, или даже раньше - при масштабном деметилировании генома на стадии примордиальных клеток. Это же подтверждают и наши исследования, в которых нарушения метилирования ретротранспозона LINE-1 наблюдались как у эмбрионов с анеуплоидией, так и у части эмбрионов с нормальным кариотипом [Vasilyev et al., 2021], что может быть следствием возникновения аномалий метилирования еще до возникновения анеуплоидии в мейозе.
Возникновение аномалий метилома в гаметогенезе и их связь с различными осложнениями беременности открывает возможности к использованию эпигенетических маркеров для прогнозирования вероятности рождения здорового ребенка. Возможными вариантами для такого тестирования в клинической практике может стать либо малоинвазивное пренатальное тестирование, либо преимплантационное тестирование при использовании вспомогательных репродуктивных технологий. Ключевым вопросом является возможность получения биологического материала от эмбриона для проведения такого тестирования. Таким материалом могут стать отдельные бластомеры, клетки трофэктодермы, жидкость из полости бластоцисты или образцы сред для культивирования эмбриона [Galluzzi et al., 2015]. В последних исследованиях было показано, что повышенный уровень метилирования генома в полярных тельцах и отдельных бластомерах связан с аномальным развитием эмбриона. Однако в настоящее время проведение новых перспективных исследований в этом направлении затруднено в связи с общемировым отказом от проведения преимплантационного тестирования на полярных тельцах и отдельных бластомерах и общим стремлением к снижению инвазивности процедур тестирования. В этой связи наиболее перспективным направлением является использование для тестирования внеклеточной ДНК из жидкости полости бластоцисты или культуральных сред. Процедура получения данного материала является малоинвазивной и может быть встроена в стандартные протоколы подготовки бластоцист к замораживанию.
Таким образом целью данного исследования является установление профиля метилирования в различных компартментах бластоцисты таких как трофэктодерма, внутренняя клеточная масса, внеклеточная ДНК из внутриполостной жидкости бластоцисты и сред для культивирования эмбриона и связь профиля метилирования с морфологическими характеристиками бластоцист.
В связи с целью были поставлены следующие задачи:
1) Провести анализ нарушения метилирования ретротрапспозона LINE-1 у
эмбрионов человека на стадии бластоцисты;
2) Провести сравнительный анализ уровня метилирования ретротранспозона LINE-1 в различных компартментах бластоцист и во внеклеточной ДНК внутриполостной жидкости и сред для культивирования;
3) Определить связь выявленных нарушений метилирования ретротранспозона LINE-1 с морфологическими изменениями в бластоцистах.
Работа проводилась на базе лаборатории инструментальной геномики НИИ медицинской генетики Томского национального исследовательского медицинского центра под руководством доктора биологических наук Васильева Станислава Анатольевича.
1) Уровень метилирования LINE-1 существенно варьировался в различных компартментах бластоцисты. Внеклеточная ДНК из жидкости полости бластоцисты и культуральной среды имела значительно большую вариабельность метилирования по сравнению с клетками внутренней клеточной массы и трофэктодермы.
2) Не обнаружено значимой корреляции между уровнями метилирования LINE- 1 во внеклеточной ДНК и в клетках внутренней клеточной массы и трофэктодермы, что указывает на различия в метилировании между клетками и внеклеточной средой. При этом уровень метилирования LINE-1 в клетках внутренней клеточной массы и трофэктодермы коррелировал друг с другом, что указывает на то, что в бластоцисте остаются клетки, метилирование которых поддерживается на одном уровне.
3) Не выявлено значимых различий по уровню метилирования LINE-1 между бластоцистами с хорошим и средним показателями качества внутренней клеточной массы и трофэктодермы, однако эмбрионы с худшими показателями качества имели как повышенные, так и пониженные уровни метилирования LINE-1 в трофэктодерме.
2) Не обнаружено значимой корреляции между уровнями метилирования LINE- 1 во внеклеточной ДНК и в клетках внутренней клеточной массы и трофэктодермы, что указывает на различия в метилировании между клетками и внеклеточной средой. При этом уровень метилирования LINE-1 в клетках внутренней клеточной массы и трофэктодермы коррелировал друг с другом, что указывает на то, что в бластоцисте остаются клетки, метилирование которых поддерживается на одном уровне.
3) Не выявлено значимых различий по уровню метилирования LINE-1 между бластоцистами с хорошим и средним показателями качества внутренней клеточной массы и трофэктодермы, однако эмбрионы с худшими показателями качества имели как повышенные, так и пониженные уровни метилирования LINE-1 в трофэктодерме.
