Термофильные микромицеты из горящих отходов добычи угля
|
Аннотация 2
Введение 4
1 Литературный обзор 7
1.1 Общие сведения о микромицетах 7
1.2 Систематика микромицетов 8
1.3 Термофильные микромицеты: температурный диапазон роста 10
1.4 Влияние рН на жизнедеятельность микромицетов 12
1.5 Внеклеточные везикулы. Устойчивость микромицетов к тяжелым металлам 14
1.6 Определение понятия «питательная среда», требования к ее составу 16
1.7 Использование углерода микромицетами 19
1.8 Понятие о культивировании микроорганизмов. Способы культивирования
аэробных и анаэробных микроорганизмов 20
1.9 Роль термофильных микромицетов в промышленности 23
1.10 Жизнедеятельность микромицетов в местах горения угля 26
1.11 Биодеградация угля термофильными микромицетами 28
1.12 Род Aspergillus 29
2 Материалы и методы 33
2.1 Отбор проб 33
2.2 Выделение чистых культур грибов 34
2.3 Питательные среды для культивирования грибов 34
2.4 Приготовление антибиотика 35
2.5 Методика посева термофильных микромицетов 35
2.6 Выделение ДНК, секвенирование и филогенетический анализ 35
2.7 Определение температурного диапазона культур 37
2.8 Определение диапазона pH питательной среды для оптимального роста культур ... 37
2.9 Определение устойчивости выделенных культур к тяжелым металлам и изучение
их возможности связывать Cu в нерастворимые соединения 38
3 Результаты 39
3.1 Выделение чистых культур и определение филогении образцов 39
3.2 Температурный диапазон выделенных культур 40
3.3 Диапазон pH питательной среды для оптимального роста выделенных культур 43
3.4 Устойчивость выделенных культур к тяжелым металлам 46
Заключение 48
Список использованной литературы 49
Приложение А: Ближайшие родственники выделенных культур 57
Введение 4
1 Литературный обзор 7
1.1 Общие сведения о микромицетах 7
1.2 Систематика микромицетов 8
1.3 Термофильные микромицеты: температурный диапазон роста 10
1.4 Влияние рН на жизнедеятельность микромицетов 12
1.5 Внеклеточные везикулы. Устойчивость микромицетов к тяжелым металлам 14
1.6 Определение понятия «питательная среда», требования к ее составу 16
1.7 Использование углерода микромицетами 19
1.8 Понятие о культивировании микроорганизмов. Способы культивирования
аэробных и анаэробных микроорганизмов 20
1.9 Роль термофильных микромицетов в промышленности 23
1.10 Жизнедеятельность микромицетов в местах горения угля 26
1.11 Биодеградация угля термофильными микромицетами 28
1.12 Род Aspergillus 29
2 Материалы и методы 33
2.1 Отбор проб 33
2.2 Выделение чистых культур грибов 34
2.3 Питательные среды для культивирования грибов 34
2.4 Приготовление антибиотика 35
2.5 Методика посева термофильных микромицетов 35
2.6 Выделение ДНК, секвенирование и филогенетический анализ 35
2.7 Определение температурного диапазона культур 37
2.8 Определение диапазона pH питательной среды для оптимального роста культур ... 37
2.9 Определение устойчивости выделенных культур к тяжелым металлам и изучение
их возможности связывать Cu в нерастворимые соединения 38
3 Результаты 39
3.1 Выделение чистых культур и определение филогении образцов 39
3.2 Температурный диапазон выделенных культур 40
3.3 Диапазон pH питательной среды для оптимального роста выделенных культур 43
3.4 Устойчивость выделенных культур к тяжелым металлам 46
Заключение 48
Список использованной литературы 49
Приложение А: Ближайшие родственники выделенных культур 57
В настоящее время промышленное производство является неотъемлемой частью современной экономики, обеспечивая производственный рост и развитие. Однако, с увеличением объемов производства начинают проявляться негативные последствия для окружающей среды. Это происходит на каждом этапе, начиная с изготовления сырья и заканчивая переработкой отходов. Общедоступная для потребления энергия всегда была необходима для удовлетворения потребностей человечества, но даже производство энергии связано с серьезным загрязнением воздуха, воды и почвы [1].
Одной из наиболее распространенных причин загрязнения водоемов и почв, нарушающего рост и развитие гидробионтов и сельскохозяйственных культур, являются сточные воды, содержащие разбавленные растворы ТМ. По токсичности эти металлы составляют последовательность такого вида: ртуть, серебро, медь, кадмий, цинк, свинец, хром, никель и кобальт. Микробиологические методы очистки являются перспективными для сорбции и выделения металлов. В настоящее время химические, физические и электрохимические методы, используемые для отчистки сточных вод от ТМ, являются дорогостоящими, трудоемкими, и не всегда обладают высокой степенью очистки. Несмотря на хорошо изученную микробиологическую детоксикацию отдельных металлов и их соединений, ведется постоянный поиск новых микроорганизмов для биологической очистки сточных вод и почвы [2].
Научная новизна данного исследования состоит в том, что в работе впервые рассмотрен механизм накопления металлов в особых структурах - везикулах, которые образуются в ответ на стресс в виде повышенного содержания меди в среде и способствуют её детоксификации. Также есть вероятность, что выделенные нами родственные виды A. fumigatus из горящих отходов добычи угля могут являться новыми.
Исследование термофильных микромицетов представляет существенный интерес для современной науки. В ходе исследований установлено, что данные организмы в состоянии производить термофильные ферменты [3], которые могут быть задействованы в промышленности, биотехнологии и для решения экологических проблем. Применение термофильных микромицетов может способствовать решению задач по очистке загрязненных почв и сточных вод.
Следует отметить, что термофильные микромицеты способны производить ферменты значительно быстрее, чем мезофильные организмы. Следовательно, использование термофильных микромицетов для производства ферментов в больших масштабах представляется наиболее выгодным решением, связанное с отсутствием необходимости в системах охлаждения для поддержания желаемой температуры [4].
Основными факторами, влияющими на благоприятное развитие термофильных грибов, являются тепло, высокая влажность и наличие органических материалов, используемых в процессе добычи угля. Анализ и определение оптимальных условий жизнедеятельности грибов, способных выдерживать высокие температуры, экстремальные значения рН, максимальные концентрации металлов в среде, является важным шагом в разработке эффективных методов и технологий, направленных на использование этих микроорганизмов в различных сферах деятельности человека. В этом и заключается актуальность данной работы.
Образцы грибов, с которыми проводилась работа, взяты в Кузбассе. Кузнецкий угольный бассейн (Кузбасс), который является одним из самых крупных угольных месторождений мира, расположен на юге Западной Сибири, в основном на территории Кемеровской области (частично - на территории Новосибирской области и Алтайского края), в неглубокой котловине между горными массивами Кузнецкого Алатау. Площадь бассейна около 26 тыс. км2. Балансовые запасы его составляют 600 млрд. тонн; мощность пластов от 6 - 14 м., а в ряде мест достигает 20 - 25 м.; средняя глубина разработки угольных пластов шахтным методом достигает 315 м. Бассейн имеет благоприятные горно-геологические условия разработки, что обеспечивает их низкую себестоимость [5].
Целью нашего исследования является выделение и получение чистых культур почвенных микромицетов из мест добычи угля, определение их филогенетического положения и физиологических характеристик.
В соответствии с поставленной целью работы были сформулированы следующие задачи:
1. Выделить и очистить термофильные микромицеты;
2. Провести филогенетический анализ штаммов по последовательности ITS;
3. Определить температурный диапазон для роста выделенных культур;
4. Определить диапазон pH питательной среды для оптимального роста выделенных культур;
5. Определить устойчивость выделенных культур к тяжелым металлам.
Работа выполнена на базе лаборатории биохимии и молекулярной биологии при кафедре физиологии растений, биотехнологии и биоинформатики Биологического института Национального исследовательского Томского государственного университета.
Автор выражает благодарность научному руководителю, заведующей кафедрой физиологии растений, биотехнологии и биоинформатики Томского государственного университета доктору биологических наук, профессору О. В. Карначук за возможность выполнить исследования на высоком методическом уровне, научному соруководителю старшему преподавателю Л. О. Соколянской за руководство и помощь в работе. Автор признателен Л. Б. Глуховой за помощь при выделении ДНК штаммов и проведении филогенетического анализа и А. Е. Калининой за помощь в проведении экспериментов и предоставлении штаммов микромицетов для работы. Всем сотрудникам кафедры физиологии растений, биотехнологии и биоинформатики, а также лаборатории биохимии и молекулярной биологии БИ НИ ТГУ.
Одной из наиболее распространенных причин загрязнения водоемов и почв, нарушающего рост и развитие гидробионтов и сельскохозяйственных культур, являются сточные воды, содержащие разбавленные растворы ТМ. По токсичности эти металлы составляют последовательность такого вида: ртуть, серебро, медь, кадмий, цинк, свинец, хром, никель и кобальт. Микробиологические методы очистки являются перспективными для сорбции и выделения металлов. В настоящее время химические, физические и электрохимические методы, используемые для отчистки сточных вод от ТМ, являются дорогостоящими, трудоемкими, и не всегда обладают высокой степенью очистки. Несмотря на хорошо изученную микробиологическую детоксикацию отдельных металлов и их соединений, ведется постоянный поиск новых микроорганизмов для биологической очистки сточных вод и почвы [2].
Научная новизна данного исследования состоит в том, что в работе впервые рассмотрен механизм накопления металлов в особых структурах - везикулах, которые образуются в ответ на стресс в виде повышенного содержания меди в среде и способствуют её детоксификации. Также есть вероятность, что выделенные нами родственные виды A. fumigatus из горящих отходов добычи угля могут являться новыми.
Исследование термофильных микромицетов представляет существенный интерес для современной науки. В ходе исследований установлено, что данные организмы в состоянии производить термофильные ферменты [3], которые могут быть задействованы в промышленности, биотехнологии и для решения экологических проблем. Применение термофильных микромицетов может способствовать решению задач по очистке загрязненных почв и сточных вод.
Следует отметить, что термофильные микромицеты способны производить ферменты значительно быстрее, чем мезофильные организмы. Следовательно, использование термофильных микромицетов для производства ферментов в больших масштабах представляется наиболее выгодным решением, связанное с отсутствием необходимости в системах охлаждения для поддержания желаемой температуры [4].
Основными факторами, влияющими на благоприятное развитие термофильных грибов, являются тепло, высокая влажность и наличие органических материалов, используемых в процессе добычи угля. Анализ и определение оптимальных условий жизнедеятельности грибов, способных выдерживать высокие температуры, экстремальные значения рН, максимальные концентрации металлов в среде, является важным шагом в разработке эффективных методов и технологий, направленных на использование этих микроорганизмов в различных сферах деятельности человека. В этом и заключается актуальность данной работы.
Образцы грибов, с которыми проводилась работа, взяты в Кузбассе. Кузнецкий угольный бассейн (Кузбасс), который является одним из самых крупных угольных месторождений мира, расположен на юге Западной Сибири, в основном на территории Кемеровской области (частично - на территории Новосибирской области и Алтайского края), в неглубокой котловине между горными массивами Кузнецкого Алатау. Площадь бассейна около 26 тыс. км2. Балансовые запасы его составляют 600 млрд. тонн; мощность пластов от 6 - 14 м., а в ряде мест достигает 20 - 25 м.; средняя глубина разработки угольных пластов шахтным методом достигает 315 м. Бассейн имеет благоприятные горно-геологические условия разработки, что обеспечивает их низкую себестоимость [5].
Целью нашего исследования является выделение и получение чистых культур почвенных микромицетов из мест добычи угля, определение их филогенетического положения и физиологических характеристик.
В соответствии с поставленной целью работы были сформулированы следующие задачи:
1. Выделить и очистить термофильные микромицеты;
2. Провести филогенетический анализ штаммов по последовательности ITS;
3. Определить температурный диапазон для роста выделенных культур;
4. Определить диапазон pH питательной среды для оптимального роста выделенных культур;
5. Определить устойчивость выделенных культур к тяжелым металлам.
Работа выполнена на базе лаборатории биохимии и молекулярной биологии при кафедре физиологии растений, биотехнологии и биоинформатики Биологического института Национального исследовательского Томского государственного университета.
Автор выражает благодарность научному руководителю, заведующей кафедрой физиологии растений, биотехнологии и биоинформатики Томского государственного университета доктору биологических наук, профессору О. В. Карначук за возможность выполнить исследования на высоком методическом уровне, научному соруководителю старшему преподавателю Л. О. Соколянской за руководство и помощь в работе. Автор признателен Л. Б. Глуховой за помощь при выделении ДНК штаммов и проведении филогенетического анализа и А. Е. Калининой за помощь в проведении экспериментов и предоставлении штаммов микромицетов для работы. Всем сотрудникам кафедры физиологии растений, биотехнологии и биоинформатики, а также лаборатории биохимии и молекулярной биологии БИ НИ ТГУ.
Исходя из поставленной цели нашего исследования, можно сделать следующие выводы:
1. Из отобранных проб были выделены термофильные микромицеты на жидких средах Чапека-Докса и S. Tsujiyama при температуре 50 - 55 °С.
2. В результате филогенетического анализа было определенно, что из проб B - 32, Bu - 33, 34, 35 и RBS - 31, 32, 33 был выделен штамм Aspergillus fumigates.
Микромицеты, растущие при температуре 50°С, родственные A. fumigatus впервые выделены из горящих отходов добычи угля. Дополнительное определение последовательностей белковых маркеров CaM, BenA и RPB2, рекомендованных для филогенетического анализа рода Aspergillus, показало, что некоторые из изолятов могут представлять новые виды.
3. В результате проведенного эксперимента по определению температурного диапазона роста проб RBS - 31, 32, 33, установили, что для штаммов RBS-31 и RBS-32 максимальная температура роста составила 50 °C, а минимальная была выше 20 °C. Для RBS-33 максимальная температура роста равна 55 °C, а минимальная 5 °C. Оптимум для штамма RBS-31 составлял 45 °С, а для штамма RBS-32 - 37 °С. Изолят RBS-33 относился к термотолерантным организмам с оптимумом 26 °С.
4. В результате проведенного эксперимента по определению оптимального диапазона pH питательных сред для выделенных культур и выращивания мицелия, было установлено, что штаммы RBS - 31, 32, 33 являются сильными алкалотолерантами. Это объясняет их способность расти в широком диапазоне значений рН, включая как слабокислые, так и щелочные среды. Образцы RBS - 31, 32, 33 слабо снижали, или не снижали совсем скорость роста на средах со щелочными значениями рН, а оптимум значений рН для их роста был часто широким, и всегда лежал в нейтральной или в кислой области.
5. В результате проведенного эксперимента по определению устойчивости выделенных культур к тяжелым металлам, было впервые рассмотрено, что штаммы RBS- 31, RBS-32 и RBS-33, относящиеся к Aspergillus fumigates, способны образовывать внеклеточные везикулы, накапливая в них излишки меди в среде, для дальнейшей её детоксификации, продолжения роста и развития мицелия в условиях снижения повышенной концентрации металла в окружающей их среде.
1. Из отобранных проб были выделены термофильные микромицеты на жидких средах Чапека-Докса и S. Tsujiyama при температуре 50 - 55 °С.
2. В результате филогенетического анализа было определенно, что из проб B - 32, Bu - 33, 34, 35 и RBS - 31, 32, 33 был выделен штамм Aspergillus fumigates.
Микромицеты, растущие при температуре 50°С, родственные A. fumigatus впервые выделены из горящих отходов добычи угля. Дополнительное определение последовательностей белковых маркеров CaM, BenA и RPB2, рекомендованных для филогенетического анализа рода Aspergillus, показало, что некоторые из изолятов могут представлять новые виды.
3. В результате проведенного эксперимента по определению температурного диапазона роста проб RBS - 31, 32, 33, установили, что для штаммов RBS-31 и RBS-32 максимальная температура роста составила 50 °C, а минимальная была выше 20 °C. Для RBS-33 максимальная температура роста равна 55 °C, а минимальная 5 °C. Оптимум для штамма RBS-31 составлял 45 °С, а для штамма RBS-32 - 37 °С. Изолят RBS-33 относился к термотолерантным организмам с оптимумом 26 °С.
4. В результате проведенного эксперимента по определению оптимального диапазона pH питательных сред для выделенных культур и выращивания мицелия, было установлено, что штаммы RBS - 31, 32, 33 являются сильными алкалотолерантами. Это объясняет их способность расти в широком диапазоне значений рН, включая как слабокислые, так и щелочные среды. Образцы RBS - 31, 32, 33 слабо снижали, или не снижали совсем скорость роста на средах со щелочными значениями рН, а оптимум значений рН для их роста был часто широким, и всегда лежал в нейтральной или в кислой области.
5. В результате проведенного эксперимента по определению устойчивости выделенных культур к тяжелым металлам, было впервые рассмотрено, что штаммы RBS- 31, RBS-32 и RBS-33, относящиеся к Aspergillus fumigates, способны образовывать внеклеточные везикулы, накапливая в них излишки меди в среде, для дальнейшей её детоксификации, продолжения роста и развития мицелия в условиях снижения повышенной концентрации металла в окружающей их среде.
