ИССЛЕДОВАНИЕ СРЕДСТВ ПРОБОПОДГОТОВКИ ДЛЯ СПЕКТРАЛЬНОГО АНАЛИЗА ГАЗОВ БИОЛОГИЧЕСКОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ
|
Реферат
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 6
ВВЕДЕНИЕ 7
1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 10
1.1 Общая информация о физиологии дыхания человека 10
1.2 Развитие исследования выдыхаемого воздуха 14
1.3 Подходы и методы исследования выдыхаемого воздуха 18
1.3.1 Газовая хроматография 21
1.3.2 Метод оптико-акустической спектроскопии 23
1.4 Метод твердофазной микроэкстракции (ТФМЭ) 26
1.5 Методы отбора ВВ с использованием BIO-VOC Breath Sampler и
пробоотборных пакетов 30
2 МЕТОДОЛОГИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ 36
2.1 Условия отбора проб с помощью Bio-VOC Breath sampler 36
2.2 Условия отбора проб в тедларовые пакеты 36
2.3 Твердофазная микроэкстакция 37
2.4 Газохроматографический анализ газов 37
2.5 Оптико-акустический анализ газа 38
3 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 39
3.1 Анализ газов с помощью газовой хроматографии 39
3.1.1 Анализ ПГС с отбором проб в тедларовые пакеты 44
3.1.2 Анализ ПГС с отбором проб в Bio-VOC Breath sampler 52
3.1.3 Анализ выдыхаемого воздуха с отбором проб в тедлровые пакеты 57
3.1.4 Анализ выдыхаемого воздуха с отбором проб в Bio-VOC Breath sampler 67
3.2 Анализ ПГС с помощью оптико-акустической спектроскопии 72
3.3 Сравнение результатов, полученных разными методами 76
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 77
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 79
ПРИЛОЖЕНИЕ Текст программы, реализующей алгоритм построения спектров 83
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 6
ВВЕДЕНИЕ 7
1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 10
1.1 Общая информация о физиологии дыхания человека 10
1.2 Развитие исследования выдыхаемого воздуха 14
1.3 Подходы и методы исследования выдыхаемого воздуха 18
1.3.1 Газовая хроматография 21
1.3.2 Метод оптико-акустической спектроскопии 23
1.4 Метод твердофазной микроэкстракции (ТФМЭ) 26
1.5 Методы отбора ВВ с использованием BIO-VOC Breath Sampler и
пробоотборных пакетов 30
2 МЕТОДОЛОГИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ 36
2.1 Условия отбора проб с помощью Bio-VOC Breath sampler 36
2.2 Условия отбора проб в тедларовые пакеты 36
2.3 Твердофазная микроэкстакция 37
2.4 Газохроматографический анализ газов 37
2.5 Оптико-акустический анализ газа 38
3 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 39
3.1 Анализ газов с помощью газовой хроматографии 39
3.1.1 Анализ ПГС с отбором проб в тедларовые пакеты 44
3.1.2 Анализ ПГС с отбором проб в Bio-VOC Breath sampler 52
3.1.3 Анализ выдыхаемого воздуха с отбором проб в тедлровые пакеты 57
3.1.4 Анализ выдыхаемого воздуха с отбором проб в Bio-VOC Breath sampler 67
3.2 Анализ ПГС с помощью оптико-акустической спектроскопии 72
3.3 Сравнение результатов, полученных разными методами 76
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 77
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 79
ПРИЛОЖЕНИЕ Текст программы, реализующей алгоритм построения спектров 83
Актуальность работы. Методы неинвазивной диагностики сегодня - уже не просто инновационные проекты с неопределенным набором функций и областью применения, они становятся нашей реальностью. Неинвазивная диагностика завоёвывает все большую популярность в медицинской практике, так как позволяет диагностировать на ранних этапах с максимальной точностью целый ряд заболеваний, для которых своевременная диагностика и лечение имеют первостепенное значение. При этом требует минимальных затрат времени и средств.
Возможности применения неинвазивных методов в медицине в ближайшей перспективе огромны. Поскольку методы могут применяться и дистанционно, они могут быть полезны при диспансеризации населения отдаленных районов. К тому же, в условиях распространения новой коронавирусной инфекции актуальность использования неизвазивной диагностики и возможности дистанционной постановки диагноза возрастает кратно росту заболеваемости.
Анализ выдыхаемого воздуха (ВВ) - быстро развивающееся направление неинвазивной медицинской диагностики. Ещё во времена Гиппократа врачи заметили, что выдох пациентов при диабете, болезнях печени и почек обладает специфическими запахами. А в 1971 г исследователь Л. Полинг доказал, что ВВ человека - не просто смесь азота, кислорода, углекислого газа и воды: с использованием газовой хроматографии он обнаружил в выдыхаемом воздухе ещё 250 компонентов [1]. Работа послужила толчком к активному изучению ВВ. Сегодня во многих университетах и клиниках мира (Италия, Нидерланды, Великобритания, Германия США, Израиль) ведутся исследования по выявлению специфических газов-маркеров различных заболеваний и отработка методик анализа ВВ в клинике. Показателем активности служит большое число публикаций, проведение ежегодной конференции Breath Analysis Summit и издание специализированного журнала Journal of Breath Research. Результатом этих исследований стала, прежде всего, обширная база маркеров, присутствующих в ВВ при различных заболеваниях. Кроме того, появились клинически апробированные методы диагностики ряда заболеваний на основе анализа ВВ.
Несложно догадаться, что содержание биомеркеров в пробах ВВ крайне низкое. Этот факт накладывает определенные ограничения не только на методы исследования газов, но и на отбор, а также транспортировку проб от пациента к диагносту. Не так давно на рынке был представлен специализированный пробоотборник для анализа ВВ - Bio- 7 VOC Breath sampler. Главным его преимуществом стала простота использования и конструкция, которая позволила отбирать последние порции ВВ. Предполагается, что такой ВВ лишен посторонних компонентов и возможных загрязнений. Однако информация об эффективности использования пробоотборника Bio-VOC сейчас несколько ограничена из-за его относительной новизны. Но растущая популярность подталкивает исследователей оценивать преимущества и недостатки этой системы в повседневной практике. Все больше авторов публикуют опыт использования и работы с Bio-VOC и оценки исследователей неоднозначны. Так, в работе Berna and all, опубликованной в журнале Analyst в 2019 году [3], диагносты пришли к выводу, что среднее количество летучих веществ, обнаруженных при отборе проб в герметичные пакеты было существенно выше, чем при использовании пробоотборников Bio-VOC (137 против 47). Сбор ВВ с помощью Bio-VOC также приводил к снижению уровня эндогенных летучих веществ в ВВ, изопрена и ацетона, даже после введения поправок. Это свидетельствует о том, что Bio-VOC разбавляет летучие вещества и вводит «мертвый воздух» или воздух окружающей среды в систему, что может исказить результаты диагностики. В свою очередь отбор ВВ в пакеты предполагает забор всего выдоха пациента. В таком случае вероятность обнаружения посторонних загрязняющих компонентов возрастает, но одновременно с этим повышается герметичность отбора и хранения пробы, а также и ее объем, что может нивелировать отрицательные стороны этого способа отбора.
Следуя опыту иностранных коллег, мы приняли решение оценить эффективность использования описанных систем отбора проб для исследования легколетучих органических соединений (далее - ЛОС) в ВВ для последующей работы в данном направлении.
Основным методом для исследования биомеркеров в ВВ в настоящее время выступает масс-спектрометрия высокого разрешения совместно с газовой хроматографией (ГХ-МС) и ее разновидности (детектирование может изменяться в зависимости от типа исследуемых веществ). Определяющим фактором при выборе метода исследования биомаркеров является чувствительность метода. Газовая хроматография высокочувствительна и достаточно селективна, но предполагает этап преконцентрирования веществ перед анализом, чего не требуется при работе с лазерной техникой. По этой причине, использование методов лазерной спектроскопии выглядит намного привлекательнее и проще для работы с подобными образцами. К сожалению, наложение спектров различных компонентов не дает возможности к настоящему моменту использовать потенциал данного метода в полной мере. Для раскрытия этого потенциала 8
необходимо поставить «реперные» опорные точки спектра, выявление которых сигнализировало бы о наличии необходимых биомеркеров.
В 21 веке уже никто не говорит о разделении сфер науки. Новых прорывных решений ищут в областях на стыке на первый взгляд несовместимых подходов к исследованию и методов. Поэтому попытка объедения знаний в области химии, физики и медицины уже определяет актуальность данной работы. А направление исследований в область интенсивно развивающейся сферы неизвазивной диагностики заболеваний только подчеркивает ее значимость.
Таким образом, была сформирована цель данной работы: оценить эффективность применения Bio-VOC Breath sampler для определения ЛОС в пробах ВВ и совместное использование методов хроматографии и лазерной спектроскопии для отработки задач по обнаружению биомеркеров в ВВ.
Для реализации поставленной цели поставлены следующие задачи:
1) Подбор оптимальных условий предварительной концентрации проб ВВ.
2) Оценка метода твердофазной экстракции на модельной смеси легколетучих компонентов разных концентраций, отобранных в тедларовый пакет с помощью метода ТФМЭ + ГХ(ПИД).
3) Оценка метода твердофазной экстракции на модельной смеси легколетучих компонентов разных концентраций, отобранных в Bio-VOC с помощью метода ТФМЭ + ГХ(ПИД).
4) Применение метода ТФМЭ + ГХ(ПИД) на реальном объекте ВВ.
5) Анализ модельной смеси легколетучих компонентов разных концентраций, отобранных в тедларовый пакет с помощью метода оптико - акустической спектроскопии.
6) Анализ модельной смеси легколетучих компонентов разных концентраций, отобранных в Bio-VOC с помощью метода оптико - акустической спектроскопии.
7) Сравнение полученных результатов и их анализ.
Практическая значимость. В работе выполнена постановка методики определения состава сильноразбавленных газовых смесей методами хроматографии и спектроскопии. Выполнена оценка эффективности твердофазной микроэкстракции для обнаружения легколетучих органических соединений в пробах выдыхаемого воздуха. Определены оптимальные условия проведения испытаний, отбора и подготовки проб к исследованию, подобраны подходящие типы волокон. Полученные результаты могут быть использованы для работ в данной области в качестве базовых методических рекомендаций.
Возможности применения неинвазивных методов в медицине в ближайшей перспективе огромны. Поскольку методы могут применяться и дистанционно, они могут быть полезны при диспансеризации населения отдаленных районов. К тому же, в условиях распространения новой коронавирусной инфекции актуальность использования неизвазивной диагностики и возможности дистанционной постановки диагноза возрастает кратно росту заболеваемости.
Анализ выдыхаемого воздуха (ВВ) - быстро развивающееся направление неинвазивной медицинской диагностики. Ещё во времена Гиппократа врачи заметили, что выдох пациентов при диабете, болезнях печени и почек обладает специфическими запахами. А в 1971 г исследователь Л. Полинг доказал, что ВВ человека - не просто смесь азота, кислорода, углекислого газа и воды: с использованием газовой хроматографии он обнаружил в выдыхаемом воздухе ещё 250 компонентов [1]. Работа послужила толчком к активному изучению ВВ. Сегодня во многих университетах и клиниках мира (Италия, Нидерланды, Великобритания, Германия США, Израиль) ведутся исследования по выявлению специфических газов-маркеров различных заболеваний и отработка методик анализа ВВ в клинике. Показателем активности служит большое число публикаций, проведение ежегодной конференции Breath Analysis Summit и издание специализированного журнала Journal of Breath Research. Результатом этих исследований стала, прежде всего, обширная база маркеров, присутствующих в ВВ при различных заболеваниях. Кроме того, появились клинически апробированные методы диагностики ряда заболеваний на основе анализа ВВ.
Несложно догадаться, что содержание биомеркеров в пробах ВВ крайне низкое. Этот факт накладывает определенные ограничения не только на методы исследования газов, но и на отбор, а также транспортировку проб от пациента к диагносту. Не так давно на рынке был представлен специализированный пробоотборник для анализа ВВ - Bio- 7 VOC Breath sampler. Главным его преимуществом стала простота использования и конструкция, которая позволила отбирать последние порции ВВ. Предполагается, что такой ВВ лишен посторонних компонентов и возможных загрязнений. Однако информация об эффективности использования пробоотборника Bio-VOC сейчас несколько ограничена из-за его относительной новизны. Но растущая популярность подталкивает исследователей оценивать преимущества и недостатки этой системы в повседневной практике. Все больше авторов публикуют опыт использования и работы с Bio-VOC и оценки исследователей неоднозначны. Так, в работе Berna and all, опубликованной в журнале Analyst в 2019 году [3], диагносты пришли к выводу, что среднее количество летучих веществ, обнаруженных при отборе проб в герметичные пакеты было существенно выше, чем при использовании пробоотборников Bio-VOC (137 против 47). Сбор ВВ с помощью Bio-VOC также приводил к снижению уровня эндогенных летучих веществ в ВВ, изопрена и ацетона, даже после введения поправок. Это свидетельствует о том, что Bio-VOC разбавляет летучие вещества и вводит «мертвый воздух» или воздух окружающей среды в систему, что может исказить результаты диагностики. В свою очередь отбор ВВ в пакеты предполагает забор всего выдоха пациента. В таком случае вероятность обнаружения посторонних загрязняющих компонентов возрастает, но одновременно с этим повышается герметичность отбора и хранения пробы, а также и ее объем, что может нивелировать отрицательные стороны этого способа отбора.
Следуя опыту иностранных коллег, мы приняли решение оценить эффективность использования описанных систем отбора проб для исследования легколетучих органических соединений (далее - ЛОС) в ВВ для последующей работы в данном направлении.
Основным методом для исследования биомеркеров в ВВ в настоящее время выступает масс-спектрометрия высокого разрешения совместно с газовой хроматографией (ГХ-МС) и ее разновидности (детектирование может изменяться в зависимости от типа исследуемых веществ). Определяющим фактором при выборе метода исследования биомаркеров является чувствительность метода. Газовая хроматография высокочувствительна и достаточно селективна, но предполагает этап преконцентрирования веществ перед анализом, чего не требуется при работе с лазерной техникой. По этой причине, использование методов лазерной спектроскопии выглядит намного привлекательнее и проще для работы с подобными образцами. К сожалению, наложение спектров различных компонентов не дает возможности к настоящему моменту использовать потенциал данного метода в полной мере. Для раскрытия этого потенциала 8
необходимо поставить «реперные» опорные точки спектра, выявление которых сигнализировало бы о наличии необходимых биомеркеров.
В 21 веке уже никто не говорит о разделении сфер науки. Новых прорывных решений ищут в областях на стыке на первый взгляд несовместимых подходов к исследованию и методов. Поэтому попытка объедения знаний в области химии, физики и медицины уже определяет актуальность данной работы. А направление исследований в область интенсивно развивающейся сферы неизвазивной диагностики заболеваний только подчеркивает ее значимость.
Таким образом, была сформирована цель данной работы: оценить эффективность применения Bio-VOC Breath sampler для определения ЛОС в пробах ВВ и совместное использование методов хроматографии и лазерной спектроскопии для отработки задач по обнаружению биомеркеров в ВВ.
Для реализации поставленной цели поставлены следующие задачи:
1) Подбор оптимальных условий предварительной концентрации проб ВВ.
2) Оценка метода твердофазной экстракции на модельной смеси легколетучих компонентов разных концентраций, отобранных в тедларовый пакет с помощью метода ТФМЭ + ГХ(ПИД).
3) Оценка метода твердофазной экстракции на модельной смеси легколетучих компонентов разных концентраций, отобранных в Bio-VOC с помощью метода ТФМЭ + ГХ(ПИД).
4) Применение метода ТФМЭ + ГХ(ПИД) на реальном объекте ВВ.
5) Анализ модельной смеси легколетучих компонентов разных концентраций, отобранных в тедларовый пакет с помощью метода оптико - акустической спектроскопии.
6) Анализ модельной смеси легколетучих компонентов разных концентраций, отобранных в Bio-VOC с помощью метода оптико - акустической спектроскопии.
7) Сравнение полученных результатов и их анализ.
Практическая значимость. В работе выполнена постановка методики определения состава сильноразбавленных газовых смесей методами хроматографии и спектроскопии. Выполнена оценка эффективности твердофазной микроэкстракции для обнаружения легколетучих органических соединений в пробах выдыхаемого воздуха. Определены оптимальные условия проведения испытаний, отбора и подготовки проб к исследованию, подобраны подходящие типы волокон. Полученные результаты могут быть использованы для работ в данной области в качестве базовых методических рекомендаций.
К основным выводам выполненной работы необходимо отнести следующие тезисы.
ГХ анализ с использованием метода ТФМЭ и отбора проб с помощью Bio-VOC показал перспективные результаты в случае с ПГС, в целом, аналогичные использованию с той же целью тедларовых пакетов. Причем, волокно CAR/PDMS предпочтительнее для исследования слабополярных углеводородов в сравнении с волокном состава PDMS/DVB. Анализируемые вещества конкурируют между собой и с матричными компонентами в процессе сорбции, что крайне негативно влияет на качество результатов исследования. В случае сильно разбавленных проб и низких концентрациях ЛОС, увеличение времени удерживания обеспечивает большее концентрирование пробы. В случае повышенных концентраций компонентов в пробах, увеличение времени сорбции приводит к обратному эффекту. Вероятно, это связано с эффектом конкурирующей сорбции, и должно быть уменьшено для корректного анализа.
Отбор проб в тедларовые пакеты в случае работы с пробами ВВ предпочтительнее Bio-VOC. При использовании Bio-VOC сложно обеспечить герметичность соединений пробоотборника, что приводит к разбавлению пробы и снижению количества детектируемых компонентов. Низкие концентрации компонентов подобных смесей накладывают определенные условия на средства, используемые для отбора проб ВВ. Герметичность - основное из них, которое, как показал эксперимент, не удается выполнить при работе с Bio-VOC совместно с ТФМЭ. В свою очередь, отбор ВВ в пакеты оставляет возможность попадания в пробу компонентов «мертвого пространства», что может исказить результаты анализа.
Вывод, который следует вынести отдельно, это обнаруженный в процессе работы основной минус ТФМЭ. Ни один ввод пробы не отразил реальных концентраций компонентов ПГС, что говорит о том, что метод подходит для качественной оценки наличия тех или иных веществ в составе анализируемых проб. К тому же количественные расчеты, выполненные с использованием данного метода концентрирования, невозможны для ЛОС, особенно при низких температурах кипения определяемых веществ (5О-100°С). Возможно эффект конкурирующей сорбции снижается с ростом температуры кипения компонента, но это предположение требует тонкой методической проверки, которая должна быть проведена направленно на определенные группы веществ непосредственно перед началом каждого нового исследования.
Метод оптико-акустической спектроскопии показал высокую точность и чувствительность, а также возможность использования разных типов пробоотборников без потери качества анализа. Но, к сожалению, идентификация компонентов в данном методе усложнена, это делает невозможным определение концентраций отдельных компонентов смеси, что усложняет сравнение результатов анализа ВВ разных пациентов.
Таким образом, использование пробоотборника Bio-VOC в данной работе показало худшие результаты в сравнении с тедларовыми пакетами, а апробация различных методов исследования ВВ выявила, что наиболее целесообразно и перспективно совместное использование методов ГХ и ОАС на практике. В первую очередь определение ключевых компонентов на качественном уровне с помощью ГХ, далее рутинный анализ ВВ методом ОАС.
ГХ анализ с использованием метода ТФМЭ и отбора проб с помощью Bio-VOC показал перспективные результаты в случае с ПГС, в целом, аналогичные использованию с той же целью тедларовых пакетов. Причем, волокно CAR/PDMS предпочтительнее для исследования слабополярных углеводородов в сравнении с волокном состава PDMS/DVB. Анализируемые вещества конкурируют между собой и с матричными компонентами в процессе сорбции, что крайне негативно влияет на качество результатов исследования. В случае сильно разбавленных проб и низких концентрациях ЛОС, увеличение времени удерживания обеспечивает большее концентрирование пробы. В случае повышенных концентраций компонентов в пробах, увеличение времени сорбции приводит к обратному эффекту. Вероятно, это связано с эффектом конкурирующей сорбции, и должно быть уменьшено для корректного анализа.
Отбор проб в тедларовые пакеты в случае работы с пробами ВВ предпочтительнее Bio-VOC. При использовании Bio-VOC сложно обеспечить герметичность соединений пробоотборника, что приводит к разбавлению пробы и снижению количества детектируемых компонентов. Низкие концентрации компонентов подобных смесей накладывают определенные условия на средства, используемые для отбора проб ВВ. Герметичность - основное из них, которое, как показал эксперимент, не удается выполнить при работе с Bio-VOC совместно с ТФМЭ. В свою очередь, отбор ВВ в пакеты оставляет возможность попадания в пробу компонентов «мертвого пространства», что может исказить результаты анализа.
Вывод, который следует вынести отдельно, это обнаруженный в процессе работы основной минус ТФМЭ. Ни один ввод пробы не отразил реальных концентраций компонентов ПГС, что говорит о том, что метод подходит для качественной оценки наличия тех или иных веществ в составе анализируемых проб. К тому же количественные расчеты, выполненные с использованием данного метода концентрирования, невозможны для ЛОС, особенно при низких температурах кипения определяемых веществ (5О-100°С). Возможно эффект конкурирующей сорбции снижается с ростом температуры кипения компонента, но это предположение требует тонкой методической проверки, которая должна быть проведена направленно на определенные группы веществ непосредственно перед началом каждого нового исследования.
Метод оптико-акустической спектроскопии показал высокую точность и чувствительность, а также возможность использования разных типов пробоотборников без потери качества анализа. Но, к сожалению, идентификация компонентов в данном методе усложнена, это делает невозможным определение концентраций отдельных компонентов смеси, что усложняет сравнение результатов анализа ВВ разных пациентов.
Таким образом, использование пробоотборника Bio-VOC в данной работе показало худшие результаты в сравнении с тедларовыми пакетами, а апробация различных методов исследования ВВ выявила, что наиболее целесообразно и перспективно совместное использование методов ГХ и ОАС на практике. В первую очередь определение ключевых компонентов на качественном уровне с помощью ГХ, далее рутинный анализ ВВ методом ОАС.
