ОПТИЧЕСКАЯ ВИЗУАЛИЗАЦИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ НА ПОДЛОЖКАХ ДЛЯ РАЗРАБОТКИ СЕНСОРНЫХ СИСТЕМ
|
РЕФЕРАТ 3
ВВЕДЕНИЕ 6
1 ТЕОРЕТИЧЕСКИЙ ОБЗОР
1.1 Место биосенсоров в клинической диагностике. 10
1.2 Классификация и общая характеристика биосенсоров 11
1.3 Разработка электрохимических аптасенсоров 16
1.4 Проблемы на пути создания аптасенсоров 18
1.5 Электрохимические методы, использующиеся для разработки
аптасенсоров. 19
1.6 Визуализация слоев на подложках 20
1.6.1 Методы визуализации, основанные на флуоресценции 20
1.6.2 Роль автофлюоресценции в визуализации слоев, исследуемых
образцов 22
1.6.3 Автоматизированная флуоресцентная цитометрия 24
1.7 Общая характеристика конфокальной флуоресцентной микроскопии
1.7.1 Принципы метода конфокальной флуоресцентной лазерной
микроскопии 25
1.7.2 Реализация метода и устройство микроскопа 31
2 ЭКСПЕРИМЕНТ
2.1 Постановка эксперимента с использованием золотого объемного и
планарного электродов. 40
2.1.1 Подготовка слоя аптамера на объемном золотом и планарном
электродах 40
2.1.2 Биологические образцы 43
2.1.3 План эксперимента 43
2.2 Получение изображений на конфокальном лазерном сканирующем
микроскопе LSM 780 NLO 45
3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 Результаты изучения слоев аптамера на поверхности объемных
золотых электродов 50
3.2 Результаты изучения слоев аптамера на поверхности планарных
золотых электродов 58
3.3 Изучение слоев аптамеров без автофлуоресценции 62
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 63
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 62
ПРИЛОЖЕНИЕ 72
ВВЕДЕНИЕ 6
1 ТЕОРЕТИЧЕСКИЙ ОБЗОР
1.1 Место биосенсоров в клинической диагностике. 10
1.2 Классификация и общая характеристика биосенсоров 11
1.3 Разработка электрохимических аптасенсоров 16
1.4 Проблемы на пути создания аптасенсоров 18
1.5 Электрохимические методы, использующиеся для разработки
аптасенсоров. 19
1.6 Визуализация слоев на подложках 20
1.6.1 Методы визуализации, основанные на флуоресценции 20
1.6.2 Роль автофлюоресценции в визуализации слоев, исследуемых
образцов 22
1.6.3 Автоматизированная флуоресцентная цитометрия 24
1.7 Общая характеристика конфокальной флуоресцентной микроскопии
1.7.1 Принципы метода конфокальной флуоресцентной лазерной
микроскопии 25
1.7.2 Реализация метода и устройство микроскопа 31
2 ЭКСПЕРИМЕНТ
2.1 Постановка эксперимента с использованием золотого объемного и
планарного электродов. 40
2.1.1 Подготовка слоя аптамера на объемном золотом и планарном
электродах 40
2.1.2 Биологические образцы 43
2.1.3 План эксперимента 43
2.2 Получение изображений на конфокальном лазерном сканирующем
микроскопе LSM 780 NLO 45
3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 Результаты изучения слоев аптамера на поверхности объемных
золотых электродов 50
3.2 Результаты изучения слоев аптамера на поверхности планарных
золотых электродов 58
3.3 Изучение слоев аптамеров без автофлуоресценции 62
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 63
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 62
ПРИЛОЖЕНИЕ 72
Актуальность работы: Эффективность медицинской помощи при различных заболеваниях, таких как инфекционные, сердечно-сосудистые, онкологические и другие, зависит от своевременности и точности их диагностики, особенно на ранних стадиях развития. Данная задача в свою очередь определяется надежностью информации о больном, а так же результатами анализов биологических жидкостей и тканей. Одной из важнейших медицинских и социально-экономических проблем в нашей стране и в большинстве развитых стран является рак легкого (РЛ). В России рак легкого в 2013 году выявлен у 58,8 тыс. человек и являлся одной из ведущих позиций в общей структуре заболеваемости злокачественными новообразованиями (12,5%), а среди мужского населения занимал первое место - 22,8% [50].
На сегодняшний день для диагностики, в медицинских учреждениях и лабораториях, используют дорогостоящее и сложное в эксплуатации оборудование. Для этого стараются использовать специальное помещение и высокую квалификацию сотрудников, но не все лечебные учреждения могут себе это позволить. Для реализации данных потребностей были введены в эксплуатацию сенсоры на основе биомолекул.
Биосенсоры постепенно занимают все более значительное и устойчивое положение в области медицинской диагностики. Они используются при физико-химическом анализе широкого спектра различных объектов из разных областей, начиная с контроля и защиты окружающей среды и заканчивая здоровьем и заботой о человеке. Биосенсоры - это сенсоры на основе биомолекул с особыми свойствами. Биомолекулы используются в качестве элемента биологического распознавания, связывания или взаимодействия с определяемыми объектами. Они связаны с детектором или преобразователем [49].
Детектор преобразует изменение, происходящее, когда целевой объект взаимодействует с биомолекулой, в измеримый сигнал. Тип детектора определяет тип датчика. В случае, если с детектором используется электрохимическая система, то мы говорим о электрохимическом биосенсоре. Электрохимические биосенсоры основаны на реакциях, в которых с поверхности электрода высвобождаются или поглощаются электроны [2].
Как правило, электрохимический биосенсор состоит из системы электродов (из двух или трех электродов) и биомолекул, связанных с индикаторным электродом. Биомолекулы часто связываются с поверхностью индикаторного электрода через химический линкер. Сигнал в отсутствие молекулы-мишени регистрируется первым. Затем молекулы целевого объекта вводятся в систему и сигнал снова записывается. Используются два типа подобных датчиков - меченные и немеченные. Последние предпочтительнее, поскольку они не требуют добавления меток к биомолекуле, что делает систему более стабильной и воспроизводимой. В случае немеченых электрохимических биосенсоров сигнал формируется окислительно-восстановительным зондом в растворе электролита - веществом, способным обратимо превращаться из одной формы в другую на поверхности электрода, формируя сигнал.
ДНК-аптамеры (далее - аптамеры) - короткие одноцепочечные олигонуклеотиды, способные с высокой аффинностью и специфичностью связываться с молекулами различной природы. Сенсоры на основе аптамеров (аптасенсоры) обладают высокой селективностью и чувствительностью определения выбранной мишени. Электрохимический аптасенсор представляет из себя индикаторный электрод, покрытый слоем аптамера, специфичного к определенной мишени [1].
Интенсивность и направление протекания электрохимических процессов в значительной мере определяется состоянием слоя аптамеров. Важным является толщина покрытия, его сплошность (непрерывность двухмерной структуры), его стабильность во времени и устойчивость к воздействиям. Несмотря на обилие работ в области создания аптасенсоров, малое число авторов уделяет достаточное внимание характеристикам модифицирующего аптамерного слоя на индикаторном электроде. Привлечение микроскопических методов для определения структуры покрытия аптамерного слоя на электродной поверхности затруднено по причине высокой чувствительности 3D структуры ДНК-аптамеров к среде. Вакуумирование при электронной микроскопии может привести к изменению конформации молекул ДНК, с потерей информации об истинном расположении аптамеров [2].
Метод конфокальной лазерной сканирующей микроскопии может быть успешно применен для микроскопического анализа объектов биологической или органической природы в условиях близких к условиям электрохимического анализа, т.е. в водной среде, хотя данный метод имеет меньшее по сравнению с электронной микроскопией пространственное разрешение. В данной работе была поставлена цель, охарактеризовать покрытие золотого электрода ДНК -аптамером, специфичным к онкомаркеру рака легкого, с использованием микроскопических методов.
Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:
1) Приготовить распознающие слои ДНК-аптамеров на объемных и планарных золотых электродах.
2) Визуализировать полученные слои с применением метода конфокальной лазерной сканирующей микроскопии.
3) Изучить влияние выдерживания аптасенсора в плазме крови здорового человека на состав и структуру распознающего слоя.
4) Сделать выводы и рекомендации по разработке методики визуализации биологических слоев на золотых аптасенсорах.
Практическая значимость работы. Полученные результаты позволят разработать методику визуализации покрытия золотого электрода с нанесенным на него ДНК-аптамером, что является необходимым для контроля процесса формирования электрохимического аптасенсора на стадии его разработки и при последующем производстве и применении.
На сегодняшний день для диагностики, в медицинских учреждениях и лабораториях, используют дорогостоящее и сложное в эксплуатации оборудование. Для этого стараются использовать специальное помещение и высокую квалификацию сотрудников, но не все лечебные учреждения могут себе это позволить. Для реализации данных потребностей были введены в эксплуатацию сенсоры на основе биомолекул.
Биосенсоры постепенно занимают все более значительное и устойчивое положение в области медицинской диагностики. Они используются при физико-химическом анализе широкого спектра различных объектов из разных областей, начиная с контроля и защиты окружающей среды и заканчивая здоровьем и заботой о человеке. Биосенсоры - это сенсоры на основе биомолекул с особыми свойствами. Биомолекулы используются в качестве элемента биологического распознавания, связывания или взаимодействия с определяемыми объектами. Они связаны с детектором или преобразователем [49].
Детектор преобразует изменение, происходящее, когда целевой объект взаимодействует с биомолекулой, в измеримый сигнал. Тип детектора определяет тип датчика. В случае, если с детектором используется электрохимическая система, то мы говорим о электрохимическом биосенсоре. Электрохимические биосенсоры основаны на реакциях, в которых с поверхности электрода высвобождаются или поглощаются электроны [2].
Как правило, электрохимический биосенсор состоит из системы электродов (из двух или трех электродов) и биомолекул, связанных с индикаторным электродом. Биомолекулы часто связываются с поверхностью индикаторного электрода через химический линкер. Сигнал в отсутствие молекулы-мишени регистрируется первым. Затем молекулы целевого объекта вводятся в систему и сигнал снова записывается. Используются два типа подобных датчиков - меченные и немеченные. Последние предпочтительнее, поскольку они не требуют добавления меток к биомолекуле, что делает систему более стабильной и воспроизводимой. В случае немеченых электрохимических биосенсоров сигнал формируется окислительно-восстановительным зондом в растворе электролита - веществом, способным обратимо превращаться из одной формы в другую на поверхности электрода, формируя сигнал.
ДНК-аптамеры (далее - аптамеры) - короткие одноцепочечные олигонуклеотиды, способные с высокой аффинностью и специфичностью связываться с молекулами различной природы. Сенсоры на основе аптамеров (аптасенсоры) обладают высокой селективностью и чувствительностью определения выбранной мишени. Электрохимический аптасенсор представляет из себя индикаторный электрод, покрытый слоем аптамера, специфичного к определенной мишени [1].
Интенсивность и направление протекания электрохимических процессов в значительной мере определяется состоянием слоя аптамеров. Важным является толщина покрытия, его сплошность (непрерывность двухмерной структуры), его стабильность во времени и устойчивость к воздействиям. Несмотря на обилие работ в области создания аптасенсоров, малое число авторов уделяет достаточное внимание характеристикам модифицирующего аптамерного слоя на индикаторном электроде. Привлечение микроскопических методов для определения структуры покрытия аптамерного слоя на электродной поверхности затруднено по причине высокой чувствительности 3D структуры ДНК-аптамеров к среде. Вакуумирование при электронной микроскопии может привести к изменению конформации молекул ДНК, с потерей информации об истинном расположении аптамеров [2].
Метод конфокальной лазерной сканирующей микроскопии может быть успешно применен для микроскопического анализа объектов биологической или органической природы в условиях близких к условиям электрохимического анализа, т.е. в водной среде, хотя данный метод имеет меньшее по сравнению с электронной микроскопией пространственное разрешение. В данной работе была поставлена цель, охарактеризовать покрытие золотого электрода ДНК -аптамером, специфичным к онкомаркеру рака легкого, с использованием микроскопических методов.
Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:
1) Приготовить распознающие слои ДНК-аптамеров на объемных и планарных золотых электродах.
2) Визуализировать полученные слои с применением метода конфокальной лазерной сканирующей микроскопии.
3) Изучить влияние выдерживания аптасенсора в плазме крови здорового человека на состав и структуру распознающего слоя.
4) Сделать выводы и рекомендации по разработке методики визуализации биологических слоев на золотых аптасенсорах.
Практическая значимость работы. Полученные результаты позволят разработать методику визуализации покрытия золотого электрода с нанесенным на него ДНК-аптамером, что является необходимым для контроля процесса формирования электрохимического аптасенсора на стадии его разработки и при последующем производстве и применении.
В результате проведенной работы были получены следующие результаты:
1) Были приготовлены распознающие слои трех разных ДНК-аптамеров на объемных и планарных золотых электродах.
2) Полученные слои были изучены с применением метода конфокальной лазерной сканирующей микроскопии. Было обнаружено, что аптамер LC-18, обладающий автофлуоресценцией, может быть визуализирован на поверхности электрода. Однако, аптамеры LC-17 и Gli-233, не обладающие автофлуоресценцией, не могут быть визуализированы без добавления специальных флуоресцентных меток.
3) Было показано, что выдерживание аптасенсора с аптамером LC-18 в плазме крови здорового человека не влияет на состав и структуру распознающего слоя. Белки из крови здорового человека не связываются с аптамером, но могут закрепляться на свободных участках поверхности электрода.
4) Сделаны выводы и сформулированы некоторые рекомендации по разработке методики визуализации биологических слоев на золотых аптасенсорах.
1) Были приготовлены распознающие слои трех разных ДНК-аптамеров на объемных и планарных золотых электродах.
2) Полученные слои были изучены с применением метода конфокальной лазерной сканирующей микроскопии. Было обнаружено, что аптамер LC-18, обладающий автофлуоресценцией, может быть визуализирован на поверхности электрода. Однако, аптамеры LC-17 и Gli-233, не обладающие автофлуоресценцией, не могут быть визуализированы без добавления специальных флуоресцентных меток.
3) Было показано, что выдерживание аптасенсора с аптамером LC-18 в плазме крови здорового человека не влияет на состав и структуру распознающего слоя. Белки из крови здорового человека не связываются с аптамером, но могут закрепляться на свободных участках поверхности электрода.
4) Сделаны выводы и сформулированы некоторые рекомендации по разработке методики визуализации биологических слоев на золотых аптасенсорах.
