АННОТАЦИЯ 3
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ 8
ВВЕДЕНИЕ 9
1 АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 11
1.1 Принципы микробиологической деструкции нефти 11
1.2 Проблемы нефтезагрязнения окружающей среды 12
1.3 Состав и структура нефти 16
1.4 Транспорт субстратов в клетки микроорганизмов 17
1.5 Описание углеводородокисляющей микрофлоры 18
1.6 Типичные представители углеводородокисляющей микрофлоры 21
1.6.1 Род Bacillus 21
1.6.2 Род Mycobacterium 23
1.6.3 Род Rhodococcus 24
1.6.4 Род Pseudomonas 25
1.7 Метод инфракрасной спектроскопии 27
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 29
2.1 Объекты исследования 29
2.1.1 Чистые культуры микроорганизмов, выделенные из нефти 29
2.1.2 Нефть Усть-Тегусского месторождения 29
2.2 Методы исследования 30
2.2.1 Методика приготовления среды МПА для учета гетеротрофной
микрофлоры 30
2.2.2 Методика оборудования стерилизации питательных сред 30
2.2.3 Метод разведения и высев на плотные агаровые среды (метод Коха) 33
2.2.4 Метод окраски по Граму 34
2.2.5 Методика определения активности каталазы 35
2.2.6 Методика определения дегидрогеназной активности 37
2.2.7 Экстракция органического вещества хлороформом из жидкой среды 39
2.2.8 Методы экстракции органического вещества в аппарате Сокслета из
твердой фазы (почвы) 41
2.2.9 Моделирование процессов биодеструкции нефти в жидкой фазе чистыми
культурами 42
2.2.10 Моделирование процессов биодеструкции нефти в жидкой фазе
ассоциациями микроорганизмов 43
2.2.11 Метод ИК-спектроскопии органического вещества нефти 44
2.2.12 Моделирование процессов биодеструкции нефти в почве 45
3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ 46
3.1 Выделение и идентификация штаммов-деструкторов нефтепродуктов 46
3.2 Деструкция нефти Усть-Тегусского месторождения чистыми культурами
микроорганизмов в водной фазе 51
3.3 Деструкция нефти в почве ассоциацией УОБ 61
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 68
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 69
ПРИЛОЖЕНИЕ А 75
ПРИЛОЖЕНИЕ Б 80
В настоящее время в связи с увеличенным спросом на нефть и нефтепродукты, невозможно избежать ситуаций аварийных разливов нефтепродуктов. Загрязнение почвы и воды углеводородами (УВ) вызывает огромный ущерб местным биоценозам, поскольку накопление загрязняющих веществ в животных и растительных тканях может привести к их гибели или мутации. В этой связи одной из важнейших задач научных исследований является поиск эффективных способов очистки почвенных и водных экосистем от загрязнений нефтью, нефтепродуктами и другими токсическими органическими соединениями.
Разработаны различные методы очистки и восстановления от разливов нефти, в том числе механические (сбор нефти с поверхности воды различными приспособлениями), физико-химические (например, контролируемое сжигание, применение различных адсорбентов, диспергирование и эмульгирование), а также биологические [1].
При использовании природных углеводородокисляющих бактерий (УОБ), не являющихся чужеродными агентами для экосистем, не возникает вторичных загрязнений, как при физико-химических способах очистки (сжигании, применнии диспергентов) [2]. Биоремедиация помогает устранить недостатки механических и физико-химических методов, а может применяться совместно с ними для повышения эффективности очистки. По сравнению с затратами на химические и физические методы, биоремедиация позволяет сэкономить до 50-70 % расходов.
К преимуществам биоремедиации относятся экологическая и гигиеническая безопасность в отношении окружающей среды, возможность целенаправленного применения в нужном месте и в нужное время, высокая скорость деструкции микроорганизмами загрязнителей на безвредные для окружающей среды продукты метаболизма бактерий [3].
Актуальность работы обусловлена необходимостью ликвидации аварийных разливов и биоремедиации нефтезагрязненных объектов окружающей среды.
Объект исследования: легкая парафинистая нефть Усть-Тегусского месторождения.
Предмет исследования: углеводородокисляющая микрофлора.
Целью данной работы является оценка эффективности деструкции нефти углеводородокисляющей микрофлорой в чистых культурах и ассоциации, в условиях водной и почвенной среды.
В соответствии с целью были сформулированы следующие задачи:
1. Выделить из нефти углеводородокисляющие бактерии и определить их родовой состав с последующим созданием архива культур.
2. Провести анализ численности и динамики ферментативной активности чистых культур и ассоциаций УОБ в процессе деструкции нефти.
3. Исследовать влияние азотсодержащего субстрата на рост УОБ, ферментативную активность и состав нефти при ее биодеструкции в жидкой среде.
4. Исследовать влияние фиторемедиации на рост УОБ, ферментативную активность и состав нефти при ее биодеструкции в почве.
Защищаемые положения:
1. Биодеградация нефти углеводородокисляющей микрофлорой обеспечивает коэффициент очистки почвы на 60-70 %.
2. Наиболее активные штаммы-биодеструкторы относятся к представителям родов Bacillus sp. и Pseudomonas sp.
Апробация результатов. Основные результаты исследований были представлены в докладах на: на международной научно-практической конференции «Химия и химические технологии в XXI веке» (Томск, 21-24 мая 2018), Финалист Премии Русского географического общества - 2018 в номинации «Лучший природоохранный проект» за проект "Очистка дна водоемов от нефти технологией бесконтактной флотации" (в ходе проекта применялась биорекультивация).
Практическая значимость:
Результаты работы в перспективе составят научную основу для разработки биотехнологий по восстановлению нефтезагрязненных почв и вод.
Работа выполнялась на базе Института химии нефти СО РАН под руководством кандидата биологических наук, доцента Л.И. Сваровской в рамках проекта НИР V.46.1.2, выполняемого коллективом Института химии нефти в соответствии с Программой фундаментальных научных исследований (ФНИ) на 2013 -2020 гг.
Автор выражает искреннюю благодарность своему научному руководителю - кандидату биологических наук, доценту Л.И. Сваровской, а также выражает признательность всем сотрудникам ИХН СО РАН за оказанное содействие и предоставленную возможность провести необходимые эксперименты.
Применение интродуцированных штаммов бактерий для биодеструкции нефти оправдано при высоких уровнях углеводородного загрязнения почв, а также при слабо развитой аборигенной микрофлоре на бедных почвах.
На основании проведенных исследований можно сделать следующие выводы:
1. В рабочую коллекцию выбраны 4 штамма бактерий, обладающих углеводородокисляющей активностью и идентифицированных как: Bacillus sp, Mycobacterium sp, Rhodococcus sp, Pseudomonas sp. Наибольшую эффективность биодеструкции проявили культуры родов Pseudomonas sp. и Bacillus sp.
2. На минеральной среде с 1 % нефти максимальный рост (до 500 млн КОЕ/мл) отмечен для культур Bacillus sp и Mycobacterium sp, а также для ассоциации всех культур. Внесение азотсодержащего органического субстрата продлило фазу экспоненциального роста ассоциации микрофлоры на 7 суток по сравнению с контролем и повысило максимальную численность в 5 раз. Потеря веса в параллельном варианте для весового контроля убыли нефти составила 85%.
3. При культивировании УОБ в нефтезагрязненной жидкой среде имеется динамика ферментативной активности: каталазная - от 1,9 до 3,4 О2/мл; дегидрогеназная - от 0,01 до 0,06 мг ТТФ на мл среды при 1 %-ном загрязнении.
4. Изучаемая ассоциация УОБ в сочетании с азотсодержащим органическим
субстратом за 60 суток обеспечила снижение нефтезагрязнения в 62%, а в дополнении с растениями-мелиорантами - на 67 %. Уменьшение содержания нефти в почве
сопровождалось изменением ее структурного состава: ростом разветвленности цепи насыщенных УВ, повышением ароматичности, окисленности, что свидетельствует о биодеградации нефти как системы.
5. Результаты этой работы (выделенные чистые культуры УОБ), состав стимулирующего субстрата могу послужить основой для разработки метода восстановления нефтезагрязненных почв.
