Помощь студентам в учебе
МИКРОБНОМ ИМАГО МАЛЯРИЙНЫХ КОМАРОВ ANOPHELES BEKLEMISHEV!, ANOPHELES DACIAE, ANOPHELESMESSEAE
|
АННОТАЦИЯ 3
ВВЕДЕНИЕ 7
1 Обзор литературы 9
1.1 Видовой состав малярийных комаров и их векторная компетентность в отношении
трансмиссивных инфекций на территории Томской области 9
1.2 Современное состояние исследований микробиома малярийных комаров 12
1.3 Методы изучения таксономического разнообразия микробиома 17
1.3.1 Технология нанопорового секвенирования 18
2 Материалы и методы 20
2.1 Сбор и фиксация малярийных комаров 20
2.2 Подготовка образцов к выделению ДНК 21
2.3 Выделение ДНК из зафиксированного биоматериала малярийных комаров 22
2.4 Измерение чистоты и концентрации ДНК в образцах на спектрофотометре 23
2.5 Измерение концентрации ДНК в образцах на флуориметре 23
2.6 Подготовка ДНК-библиотек из биоматериала малярийных комаров к
секвенированию 23
2.6.1 Амплификация гена 16S рРНК 24
2.6.2 Проверка амплификации гена 16S рРНК при помощи электрофореза в агарозном
геле 24
2.6.3 Очищение образцов после амплификации гена 16S рРНК и измерение
концентрации ДНК на флюориметре 25
2.7 Секвенирование ДНК-библиотек на приборе MinlON платформы Oxford Nanopore 26
2.8 Биоинформатический анализ результатов секвенирования 16S ДНК-библиотек 27
2.9 Статистический анализ результатов секвенирования 16S ДНК-библиотек 27
3 Результаты и обсуждение 29
3.1 Сбор и фиксация малярийных комаров 29
3.2 Подготовка образцов и выделение ДНК из зафиксированного биоматериала
малярийных комаров, а также измерение основных показателей в образцах на спектрофотометре и флюориметре 29
3.3 Подготовка ДНК-библиотек из биоматериала малярийных комаров к
секвенированию 30
3.3.1 Амплификация гена 16S рРНК и ее контроль посредством гель-электрофореза .31
3.3.2 Очищение образцов после амплификации гена 16S рРНК и измерение
концентрации ДНК на флюориметре 31
3.4 Секвенирование ДНК-библиотек на приборе MinlON платформы Oxford Nanopore 31
3.5 Биоинформатический анализ результатов секвенирования 16S ДНК-библиотек 32
3.6 Статистический анализ результатов секвенирования 16S ДНК-библиотек 32
ВЫВОДЫ 37
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 39
ПРИЛОЖЕНИЕ А 49
ПРИЛОЖЕНИЕ Б 69
ВВЕДЕНИЕ 7
1 Обзор литературы 9
1.1 Видовой состав малярийных комаров и их векторная компетентность в отношении
трансмиссивных инфекций на территории Томской области 9
1.2 Современное состояние исследований микробиома малярийных комаров 12
1.3 Методы изучения таксономического разнообразия микробиома 17
1.3.1 Технология нанопорового секвенирования 18
2 Материалы и методы 20
2.1 Сбор и фиксация малярийных комаров 20
2.2 Подготовка образцов к выделению ДНК 21
2.3 Выделение ДНК из зафиксированного биоматериала малярийных комаров 22
2.4 Измерение чистоты и концентрации ДНК в образцах на спектрофотометре 23
2.5 Измерение концентрации ДНК в образцах на флуориметре 23
2.6 Подготовка ДНК-библиотек из биоматериала малярийных комаров к
секвенированию 23
2.6.1 Амплификация гена 16S рРНК 24
2.6.2 Проверка амплификации гена 16S рРНК при помощи электрофореза в агарозном
геле 24
2.6.3 Очищение образцов после амплификации гена 16S рРНК и измерение
концентрации ДНК на флюориметре 25
2.7 Секвенирование ДНК-библиотек на приборе MinlON платформы Oxford Nanopore 26
2.8 Биоинформатический анализ результатов секвенирования 16S ДНК-библиотек 27
2.9 Статистический анализ результатов секвенирования 16S ДНК-библиотек 27
3 Результаты и обсуждение 29
3.1 Сбор и фиксация малярийных комаров 29
3.2 Подготовка образцов и выделение ДНК из зафиксированного биоматериала
малярийных комаров, а также измерение основных показателей в образцах на спектрофотометре и флюориметре 29
3.3 Подготовка ДНК-библиотек из биоматериала малярийных комаров к
секвенированию 30
3.3.1 Амплификация гена 16S рРНК и ее контроль посредством гель-электрофореза .31
3.3.2 Очищение образцов после амплификации гена 16S рРНК и измерение
концентрации ДНК на флюориметре 31
3.4 Секвенирование ДНК-библиотек на приборе MinlON платформы Oxford Nanopore 31
3.5 Биоинформатический анализ результатов секвенирования 16S ДНК-библиотек 32
3.6 Статистический анализ результатов секвенирования 16S ДНК-библиотек 32
ВЫВОДЫ 37
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 39
ПРИЛОЖЕНИЕ А 49
ПРИЛОЖЕНИЕ Б 69
В географических границах Томской области отмечают три наиболее распространенных вида малярийных комаров: Anopheles beklemishevi Stegnii & Kabanova, 1976, An. messeae Falleroni, 1926, An. daciae Linton, Nicolescu & Harbach, 2004, для которых доказано существование местных популяций [Фенология малярийных комаров ..., 2016].
Малярийные комары, начиная с рубежа XIX-XX веков, являются объектами исследований в области эпидемиологии. Они обладают векторной компетентностью в отношении возбудителя трехдневной малярии [Семенов, 2021], а также являются эффективными переносчиками дирофилярий [Distribution and ecology ..., 2009 ; Molecular detection of ..., 2014 ; Circulation of Dirofilaria ..., 2018 ; Shaikevich et al., 2019 ; Фёдорова и др., 2020]. По этой причине, одним из перспективных направлений изучения малярийных комаров является всестороннее описание их микробиома, для того чтобы: 1) охарактеризовать таксономическое разнообразие бактериальных сообществ различных органов, и в первую очередь кишечника, в зависимости от наличия или отсутствия известных патогенных микроорганизмов; 2) выявить симбиотические микроорганизмы, а также установить степень их воздействия на малярийного комара.
Проведение исследований по вышеуказанным направлениям будет способствовать расширению нашего понимания о всем разнообразии патогенных и непатогенных микроорганизмов в комарах, а также об их взаимодействиях в пределах микробиома. Это позволит разработать способы влияния генно-инженерными методами на векторную компетентность переносчиков в отношении конкретных патогенов. К настоящему времени, имеется мало информации по характеристике таксономического разнообразия бактериальных сообществ микробиома, а также определению симбиотических микроорганизмов у представителей малярийных комаров из природных популяций на территории Томской области.
Цель научно-исследовательской работы - характеристика таксономического разнообразия бактериальных сообществ в микробиоме кишечника, сперматеки и яичников у трех видов малярийных комаров An. beklemishevi, An. daciae, An. messeae, обитающих на территории Томской области.
Задачи:
1. Собрать, зафиксировать и определить видовую принадлежность малярийных
комаров из природных популяций Томской области.
2. Выделить геномную ДНК из кишечников, яичников и сперматек из зафиксированного биоматериала малярийных комаров An. beklemishevi, An. daciae, An. messeae.
3. Подготовить ДНК-библиотеки из полученной геномной ДНК кишечников, яичников и сперматек малярийных комаров для секвенирования генов 16S рРНК для платформы Oxford Nanopore.
4. Провести секвенирование подготовленных 16S ДНК-библиотек кишечников, яичников и сперматек малярийных комаров на приборе MinlON платформы Oxford Nanopore.
5. Провести биоинформатический и статистический анализ результатов секвенирования подготовленных ДНК-библиотек кишечников, яичников и сперматек малярийных комаров.
Научно-исследовательская работа была выполнена на базе Научноисследовательского института биологии и биофизики в лаборатории экологии, генетики и охраны окружающей среды в г. Томске. Выражаю особую благодарность моему научному руководителю канд. биол. наук, ст. науч. сотр. А. А. Коханенко за руководство работой, а также сотрудникам лаборатории: канд. биол. наук, ст. науч. сотр. Г. Н. Артемову и мл. науч. сотр. М. К. Хайдаре - за сбор полевого материала малярийных комаров, канд. биол. наук, ст. науч. сотр. С. С. Алексеевой - за видовую идентификацию малярийных комаров, аспиранту 3 курса, мл. науч. сотр. К. М. Кириленко - за биоинформатическую обработку результатов секвенирования.
Малярийные комары, начиная с рубежа XIX-XX веков, являются объектами исследований в области эпидемиологии. Они обладают векторной компетентностью в отношении возбудителя трехдневной малярии [Семенов, 2021], а также являются эффективными переносчиками дирофилярий [Distribution and ecology ..., 2009 ; Molecular detection of ..., 2014 ; Circulation of Dirofilaria ..., 2018 ; Shaikevich et al., 2019 ; Фёдорова и др., 2020]. По этой причине, одним из перспективных направлений изучения малярийных комаров является всестороннее описание их микробиома, для того чтобы: 1) охарактеризовать таксономическое разнообразие бактериальных сообществ различных органов, и в первую очередь кишечника, в зависимости от наличия или отсутствия известных патогенных микроорганизмов; 2) выявить симбиотические микроорганизмы, а также установить степень их воздействия на малярийного комара.
Проведение исследований по вышеуказанным направлениям будет способствовать расширению нашего понимания о всем разнообразии патогенных и непатогенных микроорганизмов в комарах, а также об их взаимодействиях в пределах микробиома. Это позволит разработать способы влияния генно-инженерными методами на векторную компетентность переносчиков в отношении конкретных патогенов. К настоящему времени, имеется мало информации по характеристике таксономического разнообразия бактериальных сообществ микробиома, а также определению симбиотических микроорганизмов у представителей малярийных комаров из природных популяций на территории Томской области.
Цель научно-исследовательской работы - характеристика таксономического разнообразия бактериальных сообществ в микробиоме кишечника, сперматеки и яичников у трех видов малярийных комаров An. beklemishevi, An. daciae, An. messeae, обитающих на территории Томской области.
Задачи:
1. Собрать, зафиксировать и определить видовую принадлежность малярийных
комаров из природных популяций Томской области.
2. Выделить геномную ДНК из кишечников, яичников и сперматек из зафиксированного биоматериала малярийных комаров An. beklemishevi, An. daciae, An. messeae.
3. Подготовить ДНК-библиотеки из полученной геномной ДНК кишечников, яичников и сперматек малярийных комаров для секвенирования генов 16S рРНК для платформы Oxford Nanopore.
4. Провести секвенирование подготовленных 16S ДНК-библиотек кишечников, яичников и сперматек малярийных комаров на приборе MinlON платформы Oxford Nanopore.
5. Провести биоинформатический и статистический анализ результатов секвенирования подготовленных ДНК-библиотек кишечников, яичников и сперматек малярийных комаров.
Научно-исследовательская работа была выполнена на базе Научноисследовательского института биологии и биофизики в лаборатории экологии, генетики и охраны окружающей среды в г. Томске. Выражаю особую благодарность моему научному руководителю канд. биол. наук, ст. науч. сотр. А. А. Коханенко за руководство работой, а также сотрудникам лаборатории: канд. биол. наук, ст. науч. сотр. Г. Н. Артемову и мл. науч. сотр. М. К. Хайдаре - за сбор полевого материала малярийных комаров, канд. биол. наук, ст. науч. сотр. С. С. Алексеевой - за видовую идентификацию малярийных комаров, аспиранту 3 курса, мл. науч. сотр. К. М. Кириленко - за биоинформатическую обработку результатов секвенирования.
1. В ходе магистерской диссертации было собрано, зафиксировано, определен вид и выделена геномная ДНК у 112 особей малярийных комаров (49 An. beklemishevi, 13 An. daciae, 50 An. messeae). На основе собранного материала были сформированы 17 ДНК- библиотек для секвенирования, из которых 5 относятся к An. beklemishevi и по 6 относятся к An. daciae и An. messeae.
2. По итогам секвенирования и биоинформатической обработки данных 17 ДНК-библиотек в микробиоме анализируемых видов после было классифицировано 433 вида, 153 рода и 68 семейств. Наиболее распространенными родами являются Aeromonas, Erwinia, Pantoea, Pseudomonas, Chitinibacter, Massilia, Snodgrassella, Acinetobacter и Staphylococcus.
3. Для микробиома кишечников малярийных комаров характерно высокое таксономическое разнообразие, которое меняется в зависимости от стадии питания. Полученные данные свидетельствуют, что вид комара не оказывает влияния на разнообразие. Наибольшим разнообразием характеризуется стадия напитавшихся кровью комаров (WB). У непитавшихся комаров (C) наиболее представленными являются роды Aeromonas (у An.beklemishevi, An. messeae), и Chitinibacter и Massilia (у An. daciae), на стадии напитавшихся кровью (WB) - роды Erwinia и Pantoea (для всех видов) и на стадии переваривших кровь (NB) - роды Massilia (у An. daciae) и Sphingomonas (у An. messeae).
4. Для микробиома сперматек малярийных комаров характерно однородное распределение таксонов бактерий. На структуру бактериальных сообществ вид комара и стадия питания не оказывают влияния. Наиболее представленными являются рода Escherichia, Shigella (шигеллез) и Salmonella (сальмонеллез). Они преобладают на двух стадия (напитавшихся (WB) и переваривших кровь (NB)) у всех трех видов малярийных комаров.
5. Для микробиома яичников малярийных комаров показано влияние вида
комара на структуру бактериальных сообществ. Состав микробиома An.daciae отличается от An. beklemishevi и An. messeae (p = 1,79*10-5 и p = 0,001142, соответственно).
Статистически значимых различий в составе микробиома яичников An. beklemishevi и An. messeae не выявлено (p = 0,2133). Для An. beklemishevi наиболее представленными являются рода Escherichia, Staphylococcus и Shigella, для An. daciae - Massilia и для An. messeae - Escherichia, Staphylococcus и Shigella.
6. Среди бактерий были обнаружены описанные ранее симбионты комаров: в кишечниках - бактерия Pantoea agglomerans симбионт комаров An. albimanus, An. gambiae, An. stephensi, в сперматеках - бактерия Thorsellia anophelis симбионт комара An. gambiae, в яичниках - Staphylococcus hominis симбионт комара Culex pipiens и Acinetobacter johnsonii симбионт комара Aedes albopictus.
2. По итогам секвенирования и биоинформатической обработки данных 17 ДНК-библиотек в микробиоме анализируемых видов после было классифицировано 433 вида, 153 рода и 68 семейств. Наиболее распространенными родами являются Aeromonas, Erwinia, Pantoea, Pseudomonas, Chitinibacter, Massilia, Snodgrassella, Acinetobacter и Staphylococcus.
3. Для микробиома кишечников малярийных комаров характерно высокое таксономическое разнообразие, которое меняется в зависимости от стадии питания. Полученные данные свидетельствуют, что вид комара не оказывает влияния на разнообразие. Наибольшим разнообразием характеризуется стадия напитавшихся кровью комаров (WB). У непитавшихся комаров (C) наиболее представленными являются роды Aeromonas (у An.beklemishevi, An. messeae), и Chitinibacter и Massilia (у An. daciae), на стадии напитавшихся кровью (WB) - роды Erwinia и Pantoea (для всех видов) и на стадии переваривших кровь (NB) - роды Massilia (у An. daciae) и Sphingomonas (у An. messeae).
4. Для микробиома сперматек малярийных комаров характерно однородное распределение таксонов бактерий. На структуру бактериальных сообществ вид комара и стадия питания не оказывают влияния. Наиболее представленными являются рода Escherichia, Shigella (шигеллез) и Salmonella (сальмонеллез). Они преобладают на двух стадия (напитавшихся (WB) и переваривших кровь (NB)) у всех трех видов малярийных комаров.
5. Для микробиома яичников малярийных комаров показано влияние вида
комара на структуру бактериальных сообществ. Состав микробиома An.daciae отличается от An. beklemishevi и An. messeae (p = 1,79*10-5 и p = 0,001142, соответственно).
Статистически значимых различий в составе микробиома яичников An. beklemishevi и An. messeae не выявлено (p = 0,2133). Для An. beklemishevi наиболее представленными являются рода Escherichia, Staphylococcus и Shigella, для An. daciae - Massilia и для An. messeae - Escherichia, Staphylococcus и Shigella.
6. Среди бактерий были обнаружены описанные ранее симбионты комаров: в кишечниках - бактерия Pantoea agglomerans симбионт комаров An. albimanus, An. gambiae, An. stephensi, в сперматеках - бактерия Thorsellia anophelis симбионт комара An. gambiae, в яичниках - Staphylococcus hominis симбионт комара Culex pipiens и Acinetobacter johnsonii симбионт комара Aedes albopictus.
