Экспрессия генов химиорезистентности и химиочувствительности у больных немелкоклеточным раком лёгкого в процессе неоадъювантной химиотерапии
|
Аннотация
Перечень условных обозначений, сокращений 4
Аннотация Error! Bookmark not defined.
Введение 5
Глава 1. Литературный обзор 9
1.1 Рак легкого 9
1.1.1 Классификация рака легких 10
1.1.2 Клинико-анатомическая классификация 11
1.1.3 Гистологическая классификация опухолей легких 11
1.2 Способы лечения НМРЛ 12
1.2.1 Хирургическое лечение НМРЛ 12
1.2.2 Неоадъювантная химиотерапия 13
1.2.3 Адъювантная химиотерапия (послеоперационная химиотерапия) 14
1.3 Химиорезистентность при НМРЛ 15
1.3.1 АВС - транспортеры 17
1.4 Химиочувствительность при НМРЛ 23
1.4.1 Гены химиочувствительности 23
Глава 2. Материал и методы 33
2.1 Материал для исследования 34
2.2 Методы 34
Глава 3. Результаты и обсуждение 39
3.1 Оценка уровня экспрессии исследуемых генов ABC-транспортеров и генов
химичувствительности и их связь с основными клин-пат параментрами 39
3.2 Связь экспрессии генов ABC-транспортеров с эффективностью НХТ и
прогнозом заболевания 43
3.3 Связь экспрессии генов химиочувствительности с эффективностью НХТ и
прогнозом заболевания 50
Выводы 54
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 55
Перечень условных обозначений, сокращений 4
Аннотация Error! Bookmark not defined.
Введение 5
Глава 1. Литературный обзор 9
1.1 Рак легкого 9
1.1.1 Классификация рака легких 10
1.1.2 Клинико-анатомическая классификация 11
1.1.3 Гистологическая классификация опухолей легких 11
1.2 Способы лечения НМРЛ 12
1.2.1 Хирургическое лечение НМРЛ 12
1.2.2 Неоадъювантная химиотерапия 13
1.2.3 Адъювантная химиотерапия (послеоперационная химиотерапия) 14
1.3 Химиорезистентность при НМРЛ 15
1.3.1 АВС - транспортеры 17
1.4 Химиочувствительность при НМРЛ 23
1.4.1 Гены химиочувствительности 23
Глава 2. Материал и методы 33
2.1 Материал для исследования 34
2.2 Методы 34
Глава 3. Результаты и обсуждение 39
3.1 Оценка уровня экспрессии исследуемых генов ABC-транспортеров и генов
химичувствительности и их связь с основными клин-пат параментрами 39
3.2 Связь экспрессии генов ABC-транспортеров с эффективностью НХТ и
прогнозом заболевания 43
3.3 Связь экспрессии генов химиочувствительности с эффективностью НХТ и
прогнозом заболевания 50
Выводы 54
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 55
Сегодня онкопатология легких занимает второе место по количеству обнаруженных случаев и является первой по смертности от рака во всем мире (Фоменко А. В., 2018). Немелкоклеточный рак легкого (НМРЛ) составляет около 85% всех случаев рака легкого (РЛ). Местно-распространенная форма или III стадия болезни встречается у 30% пациентов с НМРЛ (Колбанов К., 2016). Лечение III стадии является сложной и противоречивой задачей, что большей частью связано с разными степенями распространенности первичной опухоли. Условная радикальность хирургического вмешательства при III стадии НМРЛ обусловлена высокой вероятностью наличия возникновения метастазов, поэтому в лечении данных больных применяют системную химиотерапию (Kastelijn E. A., 2019). Список стандартных химиопрепаратов, которые чаще всего используются для лечения НМРЛ, достаточно ограничен и включает в себя препараты платины, этопозид, таксаны, доксорубицин, гемцитабин, винорелбин и т.д. Обычно, используются платиносодержащие дублеты с другими цитостатиками из представленного списка (Тюляндин С., 2010). Но несмотря на огромные усилия, направленные на разработку новых схем химиотерапии, терапевтические результаты остаются неудовлетворительными (Schiller J. H., 2002). Так установлено, что эффективность применяемой неоадъювантной (предоперационной) химиотерапии (НХТ) у больных НМРЛ варьируется (Felip E., 2010; Pisters K. M., 2010; Scagliotti G. V., 2011). Так в работе Pisters K. et al. (Pisters K., 1993) авторы сообщили о 12% больных, которые достигли полного ответа (9 из 73 случаев), Roth J.A. et al. (Roth J. A., 1994) показали отсутствие эффективности НХТ у 28 пациентов, в исследовании Rosell R. et al. (Rosell R., 1994) всего у 3% (1 из 30) пациентов наблюдался положительный ответ на лечение. В целом, средний показатель полного патологического ответа, описанный в исследованиях, составляет всего 4% (диапазон 0-16%).
С точки зрения прогноза, местнораспространенный рак разделяют на IIIA стадию с 24%-й 5-летней выживаемостью и IIIB стадию с неблагоприятным прогнозом и 9%-й 5-летней выживаемостью (Crino L., 2010). К сожалению, постоянное совершенствование хирургического метода, а также применения различных комбинаций адъювантной (послеоперационной) химиотерапии (АХТ), заметной тенденции к улучшению не дает положительных результатов. У большинства больных НМРЛ III стадии (35-50%) процесс прогрессирования заболевания происходит за счет возникновения отдаленных метастазов(Трахтенберг А. Х., 2008; Crino L., 2010). Эффективность лекарственной
терапии опухолей может обуславливаться совокупностью ряда групп факторов, включающих: основные клинико-морфологические параметры опухолевого процесса; генетические особенности организма, связанные с нормальной генетической изменчивостью генов, вовлеченных в регуляцию жизнедеятельности организма и опухоли и метаболизм лекарственных средств; физиологические особенности организма, которые определяют фон развития и прогрессии опухоли; молекулярно-генетические особенности опухоли, связанные с изменениями (мутации, гипо -/гиперметилирование, амплифик ация и др.) в онкогенах, в генах-супрессорах и генах-модификаторах, а также с изменениями в паттерне экспрессии многочисленных генов метаболических путей активации лекарственных средств, транспортных генов, генов ферментных систем инактивации ксенобиотиков и т.п. (Olaussen K. A., 2006; Hansen H. H., 2008).
Одной из основных причин неэффективности химиотерапии опухоли считается формирование, под действием лекарственных средств, фенотипа адаптивной множественной лекарственной устойчивости (МЛУ). Возникновение МЛУ обусловлено повышением экспрессии генов АВС-транспортеров, выбрасывающих широкий спектр химиопрепаратов из опухолевых клеток против градиента концентрации с затратой энергии АТФ (Gottesman M. M., 2002; Gillet J.-P., 2011). Семейство ABC-транспортеров (ATP-Binding Cassette), насчитывает около 50 представителей и наиболее известные из них: ABCB1, ABCB3, ABCC1, ABCC2, ABCC5, ABCG1 и ABCG2. Роль этих генов в развитии МЛУ была доказана в опытах по их трансфекции в чувствительные к цитостатикам линии клеток и в экспериментах in vitro (Raghu G., 1996; Szakacs G., 2008). Было установлено, что АВС-транспортеры определяют около 70-85% случаев низкой эффективности системной химиотерапии (Robey R. W., 2018). В частности было отмечено, что гиперэкспрессия в опухолевой ткани легкого генов АВСВ1, АВСС1 и др. до лечения была связана не только с плохим ответом на НХТ, но и также с низкими показателями общей и безметастатической выживаемости (Cuffe S., 2012; Seeree P., 2019).
Еще одним из подходов к индивидуализации химиотерапии НМРЛ является оценка экспрессии генов химиочувствительности, которые определяют чувствительность опухолевых клеток к отдельным химиотерапевтическим препаратам и назначение схемы химиотерапии зависит от уровня их экспрессии (Tsyganov M., 2014). Так, продукт гена эксцизионной репарации (ERCC1) представляет собой структурно специфичную эндонуклеазу, которая участвует в процессе репарации ДНК. Связь между экспрессией мРНК ERCC1 и устойчивостью к соединениям платины была подтверждена ретроспективными клиническими исследованиями у пациентов с раком желудка, яичников, колоректального рака, пищевода и немелкоклеточным раком легкого (Metzger R., 1998; Lord R. V., 2002; Altaha R., 2004). Работы доказывают, что гиперэкспрессия ERCC1 связана с устойчивостью к химиотерапии на основе препаратов платины (Li J.,
2010; Tsyganov M., 2014). Также исследование De Luca P. (De Luca P., 2016) показало, что гиперэкспрессия гена BRCA1 связана с низкой эффективностью химиотерапии на основе цисплатина и низкими показателями безрецидивной и общей выживаемости. Гипоэкспрессия гена RRM1 является предиктором высокой выживаемости при лечении химиотерапией гемцитабином (Yuan Z.-J., 2015). Для фермента тимидилатсинтазы (TYMS) установлено, что его высокая экспрессия статистически значимо взаимосвязана с чувствительностью к гемцитабину (Yu Y., 2014). Сверхэкспрессия /3-тубулина (TUBB3) связана с устойчивостью к доцетакселу и паклитакселу (Azuma K., 2009; Singh S., 2009). За устойчивость к доксорубицину отвечает группа генов топоизомеразы, основными из которых являются топоизомераза 1 (TOP1) и 2а (TOP2a) (Vulsteke C., 2013). Эти
ферменты изменяют топологию ДНК, катализируют раскручивание суперспиралей ДНК, разрыв и сшивание молекул нуклеиновых кислот. Недавние исследования показали, что TOP2a может быть хорошим прогностическим фактором при лечении пациентов с НМРЛ (Ma W., 2019).
Кодирующей области гена GSTP1 предшествует большая область, богатая CpG, на которую часто влияет метилирование. При многих типах рака GSTP1 подвержен гиперметилированию и, как следствие, имеет низкую экспрессию (Gurioli G., 2018;
Izumchenko E., 2019). В качестве биомаркера он в основном исследовался при раке предстательной железы (РПЖ), где он показал высокую специфичность, но низкую чувствительность и поэтому рекомендуется в сочетании с другими биомаркерами (Gurioli G., 2018).
Таким образом, на сегодняшний день, является актуальным исследования фундаментальных аспектов формирования фенотипа МЛУ у больных РЛ, а так же поиск молекулярно-генетических маркеров химиочувствительности опухолевых клеток. На основании этого перспективным направлением может рассматриваться разработка новых предиктивных и прогностических критериев для максимальной персонализации при назначении химиотерапии, которые будут учитывать индивидуальные особенности организма больного и опухоли в соответствии с принципами молекулярной онкологии и фармакогеномики.
Цель магистерской работы: исследование экспрессии генов АВС-транспортеров и химиочувствительности в нормальной и опухолевой ткани у больных немелкоклеточным раком легкого.
Задачи исследования:
1. Оценить уровень экспрессии исследуемых генов ABC-транспортеров (ABCB1, ABCB3, ABCC1, ABCC2, ABCC5, ABCG1 и ABCG2) и химиочувствительности (ERCC1, RRM1, TUBB3, TYMS, TOP1, TOP2A, BRCA1 и GSTPT) в биопсийном и операционном материале нормальной и опухолевой ткани легкого.
2. Провести анализ связи экспрессии исследуемых генов с основными клинико-патологическими параметрами пациентов.
3. Провести анализ связи экспрессии исследуемых генов с эффективностью неоадъювантной химиотерапии.
4. Оценить прогностическую значимость экспрессии генов ABC-транспортеров и генов химиочувствительности у больных немелкоклеточным раком легкого.
С точки зрения прогноза, местнораспространенный рак разделяют на IIIA стадию с 24%-й 5-летней выживаемостью и IIIB стадию с неблагоприятным прогнозом и 9%-й 5-летней выживаемостью (Crino L., 2010). К сожалению, постоянное совершенствование хирургического метода, а также применения различных комбинаций адъювантной (послеоперационной) химиотерапии (АХТ), заметной тенденции к улучшению не дает положительных результатов. У большинства больных НМРЛ III стадии (35-50%) процесс прогрессирования заболевания происходит за счет возникновения отдаленных метастазов(Трахтенберг А. Х., 2008; Crino L., 2010). Эффективность лекарственной
терапии опухолей может обуславливаться совокупностью ряда групп факторов, включающих: основные клинико-морфологические параметры опухолевого процесса; генетические особенности организма, связанные с нормальной генетической изменчивостью генов, вовлеченных в регуляцию жизнедеятельности организма и опухоли и метаболизм лекарственных средств; физиологические особенности организма, которые определяют фон развития и прогрессии опухоли; молекулярно-генетические особенности опухоли, связанные с изменениями (мутации, гипо -/гиперметилирование, амплифик ация и др.) в онкогенах, в генах-супрессорах и генах-модификаторах, а также с изменениями в паттерне экспрессии многочисленных генов метаболических путей активации лекарственных средств, транспортных генов, генов ферментных систем инактивации ксенобиотиков и т.п. (Olaussen K. A., 2006; Hansen H. H., 2008).
Одной из основных причин неэффективности химиотерапии опухоли считается формирование, под действием лекарственных средств, фенотипа адаптивной множественной лекарственной устойчивости (МЛУ). Возникновение МЛУ обусловлено повышением экспрессии генов АВС-транспортеров, выбрасывающих широкий спектр химиопрепаратов из опухолевых клеток против градиента концентрации с затратой энергии АТФ (Gottesman M. M., 2002; Gillet J.-P., 2011). Семейство ABC-транспортеров (ATP-Binding Cassette), насчитывает около 50 представителей и наиболее известные из них: ABCB1, ABCB3, ABCC1, ABCC2, ABCC5, ABCG1 и ABCG2. Роль этих генов в развитии МЛУ была доказана в опытах по их трансфекции в чувствительные к цитостатикам линии клеток и в экспериментах in vitro (Raghu G., 1996; Szakacs G., 2008). Было установлено, что АВС-транспортеры определяют около 70-85% случаев низкой эффективности системной химиотерапии (Robey R. W., 2018). В частности было отмечено, что гиперэкспрессия в опухолевой ткани легкого генов АВСВ1, АВСС1 и др. до лечения была связана не только с плохим ответом на НХТ, но и также с низкими показателями общей и безметастатической выживаемости (Cuffe S., 2012; Seeree P., 2019).
Еще одним из подходов к индивидуализации химиотерапии НМРЛ является оценка экспрессии генов химиочувствительности, которые определяют чувствительность опухолевых клеток к отдельным химиотерапевтическим препаратам и назначение схемы химиотерапии зависит от уровня их экспрессии (Tsyganov M., 2014). Так, продукт гена эксцизионной репарации (ERCC1) представляет собой структурно специфичную эндонуклеазу, которая участвует в процессе репарации ДНК. Связь между экспрессией мРНК ERCC1 и устойчивостью к соединениям платины была подтверждена ретроспективными клиническими исследованиями у пациентов с раком желудка, яичников, колоректального рака, пищевода и немелкоклеточным раком легкого (Metzger R., 1998; Lord R. V., 2002; Altaha R., 2004). Работы доказывают, что гиперэкспрессия ERCC1 связана с устойчивостью к химиотерапии на основе препаратов платины (Li J.,
2010; Tsyganov M., 2014). Также исследование De Luca P. (De Luca P., 2016) показало, что гиперэкспрессия гена BRCA1 связана с низкой эффективностью химиотерапии на основе цисплатина и низкими показателями безрецидивной и общей выживаемости. Гипоэкспрессия гена RRM1 является предиктором высокой выживаемости при лечении химиотерапией гемцитабином (Yuan Z.-J., 2015). Для фермента тимидилатсинтазы (TYMS) установлено, что его высокая экспрессия статистически значимо взаимосвязана с чувствительностью к гемцитабину (Yu Y., 2014). Сверхэкспрессия /3-тубулина (TUBB3) связана с устойчивостью к доцетакселу и паклитакселу (Azuma K., 2009; Singh S., 2009). За устойчивость к доксорубицину отвечает группа генов топоизомеразы, основными из которых являются топоизомераза 1 (TOP1) и 2а (TOP2a) (Vulsteke C., 2013). Эти
ферменты изменяют топологию ДНК, катализируют раскручивание суперспиралей ДНК, разрыв и сшивание молекул нуклеиновых кислот. Недавние исследования показали, что TOP2a может быть хорошим прогностическим фактором при лечении пациентов с НМРЛ (Ma W., 2019).
Кодирующей области гена GSTP1 предшествует большая область, богатая CpG, на которую часто влияет метилирование. При многих типах рака GSTP1 подвержен гиперметилированию и, как следствие, имеет низкую экспрессию (Gurioli G., 2018;
Izumchenko E., 2019). В качестве биомаркера он в основном исследовался при раке предстательной железы (РПЖ), где он показал высокую специфичность, но низкую чувствительность и поэтому рекомендуется в сочетании с другими биомаркерами (Gurioli G., 2018).
Таким образом, на сегодняшний день, является актуальным исследования фундаментальных аспектов формирования фенотипа МЛУ у больных РЛ, а так же поиск молекулярно-генетических маркеров химиочувствительности опухолевых клеток. На основании этого перспективным направлением может рассматриваться разработка новых предиктивных и прогностических критериев для максимальной персонализации при назначении химиотерапии, которые будут учитывать индивидуальные особенности организма больного и опухоли в соответствии с принципами молекулярной онкологии и фармакогеномики.
Цель магистерской работы: исследование экспрессии генов АВС-транспортеров и химиочувствительности в нормальной и опухолевой ткани у больных немелкоклеточным раком легкого.
Задачи исследования:
1. Оценить уровень экспрессии исследуемых генов ABC-транспортеров (ABCB1, ABCB3, ABCC1, ABCC2, ABCC5, ABCG1 и ABCG2) и химиочувствительности (ERCC1, RRM1, TUBB3, TYMS, TOP1, TOP2A, BRCA1 и GSTPT) в биопсийном и операционном материале нормальной и опухолевой ткани легкого.
2. Провести анализ связи экспрессии исследуемых генов с основными клинико-патологическими параметрами пациентов.
3. Провести анализ связи экспрессии исследуемых генов с эффективностью неоадъювантной химиотерапии.
4. Оценить прогностическую значимость экспрессии генов ABC-транспортеров и генов химиочувствительности у больных немелкоклеточным раком легкого.
3. База данных. Для выполнения исследований была создана электронные базы данных
для регистрации пациентов со злокачественными новообразованиями рака легкого, обратившихся в клинику НИИ онкологии. На электронную базу данных получено регистрационное: Свидетельство о государственной регистрации базы данных №
2017620873 от 10 августа 2017 г. «База данных экспрессионных и клинико - патологических параметров пациентов с диагнозом рак легкого». База является основой при проведении исследований с целью оптимизации стратегии химиотерапии рака легкого на основе факторов химиорезистентности и химиочувствительности. В базе ведется учет состояния больного при первичном обращении и после проведенного химиотерапевтического и операционного, а также представлены подробные гистоморфологические характеристики опухоли для последующего сопоставления с экспрессионными профилями опухолевой ткани пациентов в процессе химиотерапии. Электронная база данных позволяет проводить многоаспектный поиск по любому полю или совокупности полей входного формата, систематизировать отобранный массив, а также проводить просмотр и распечатку сведений по заданным условиям с расположением полей в удобной последовательности. База рабочая, постоянно пополняется.
4. Статистическая обработка результатов. Статистическая обработка данных проводилась с использованием пакета прикладных программ «Statistica 8.0» (StatSoft Inc., USA). Для каждой выборки вычисляли среднее арифметическое и среднюю квадратичную ошибку. Для проверки гипотезы о значимости различий между исследуемыми группами использовали критерий Вилкоксона-Манна-Уитни. В отдельных случаях использовали логистическую регрессию для определения связи изучаемых параметров. Различия между исследуемыми группами считались статистически значимыми при уровне значимости p<0,05. Для анализа безрецидивной и общей выживаемости использовались кривые выживаемости, построенные по методу Каплана-Майера (Kaplan E. L., 1958). Сравнение статистической значимости различий между группами производилось с помощью log-rank теста. Сравнение частот по качественным данным анализировали при помощи двухстороннего критерия Фишера.
для регистрации пациентов со злокачественными новообразованиями рака легкого, обратившихся в клинику НИИ онкологии. На электронную базу данных получено регистрационное: Свидетельство о государственной регистрации базы данных №
2017620873 от 10 августа 2017 г. «База данных экспрессионных и клинико - патологических параметров пациентов с диагнозом рак легкого». База является основой при проведении исследований с целью оптимизации стратегии химиотерапии рака легкого на основе факторов химиорезистентности и химиочувствительности. В базе ведется учет состояния больного при первичном обращении и после проведенного химиотерапевтического и операционного, а также представлены подробные гистоморфологические характеристики опухоли для последующего сопоставления с экспрессионными профилями опухолевой ткани пациентов в процессе химиотерапии. Электронная база данных позволяет проводить многоаспектный поиск по любому полю или совокупности полей входного формата, систематизировать отобранный массив, а также проводить просмотр и распечатку сведений по заданным условиям с расположением полей в удобной последовательности. База рабочая, постоянно пополняется.
4. Статистическая обработка результатов. Статистическая обработка данных проводилась с использованием пакета прикладных программ «Statistica 8.0» (StatSoft Inc., USA). Для каждой выборки вычисляли среднее арифметическое и среднюю квадратичную ошибку. Для проверки гипотезы о значимости различий между исследуемыми группами использовали критерий Вилкоксона-Манна-Уитни. В отдельных случаях использовали логистическую регрессию для определения связи изучаемых параметров. Различия между исследуемыми группами считались статистически значимыми при уровне значимости p<0,05. Для анализа безрецидивной и общей выживаемости использовались кривые выживаемости, построенные по методу Каплана-Майера (Kaplan E. L., 1958). Сравнение статистической значимости различий между группами производилось с помощью log-rank теста. Сравнение частот по качественным данным анализировали при помощи двухстороннего критерия Фишера.