СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 4
ВВЕДЕНИЕ 5
1. СПОСОБЫ ОТЧИСТКИ НЕФТЯНЫХ ЗАГРЯЗНЕНИЙ 8
2. МИКРOБИOЛOГИЧEСКOE ОКИСЛЕНИЕ УГЛЕBOДOРOДOВ №ФТИ И
HEФTEПPOДУКTOB 13
2.1 Распространение углеводородокисляющих микроорганизмов в природе 13
2.2 Пути поступления углеводородов в клетки микроорганизмов 13
2.3 Биогенное окисление нефтей различных по химическому составу 16
2.4 Окисление нормальных парафинов (алканов) 17
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 19
3.1 Характеристика объекта исследования 19
3.2 Определение общей численности основных групп микроорганизмов 19
3.3 Методы культивирования микроорганизмов -нефтедеструкторов 20
3.3.1 Подготовка посуды для посева 21
3.3.2 Работа в ламинарном боксе 21
3.3.3 Посев в лабораторных условиях микроогранизмов-нефтедеструкторов 21
3.4 Микроскопия 22
3.5 Получение накопительной культуры 22
3.5.1 Метод предельных разведений 23
3.6 Выделение чистых культур 24
3.7 Изучение физиологии 24
3.7.1 Температурные границы роста штаммов 24
3.7.2. Определение оптимальных показателей pH 25
3.7.2.1 Приготовление растворов для коррекции pH в среде 25
3.8 Определение белка по методу Лоури 26
3.8.1 Построение калибровочной кривой 27
3.9 Методы молекулярной биологии 32
3.9.1 Фенольный метод выделения ДНК 32
3.9.2 Амплификация ДНК прокариот 33
4 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 37
5.1 Определение общей численности основных групп микроорганизмов 37
5.2 Получение накопительной культуры микроогранизмов- 37
нефтедеструкторов 37
5.3 Выделение чистых культур микроогранизмов-нефтедеструкторов 38
5.4 Физиология микроогранизмов-нефтедеструкторов 40
5.6 Филогенетический анализ 44
ВЫВОДЫ 48
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 49
Нефть и ее производные - одни из самых распространенных загрязнителей биосферы. Предприятия нефтегазового комплекса (НГК) оказывают значительную нагрузку на окружающую среду. Это происходит практически на всех этапах производственной цепочки: добыче, транспортировке, переработке и хранении. Особенную угрозу представляет попадание нефти и нефтепродуктов в водные объекты со сточными водами или в результате нефтеразливов. Поэтому, создание технологий и материалов для обезвреживания и утилизации отходов предприятий НГК, для ликвидаций аварийных нефтеразливов и разработка природоохранных мероприятий на их основе является крайне актуальной задачей, стоящей перед нефтехимиками и экологами. Об этом свидетельствует постановление, подписанное в ноябре 2014 года премьер-министром РФ, которое определяет порядок разработки российскими компаниями планов по предупреждению и ликвидации разливов нефти и нефтепродуктов (Постановления Правительства РФ от 14.11.2014 N 1188).
Наряду со сточными водами, нефтяные разливы представляют серьезную проблему для окружающей среды. По разным оценкам, объемы утечки нефти в России составляют до 25 млн. т в год. Известно, что 1 л нефти загрязняет до 1000 м3 воды, что обусловлено присутствием в ней природных поверхностноактивных веществ, которые образуют стабильные нефтеводные эмульсии (Ган- дурина Л.В., 1987).
Нефть и нефтепродукты образуют на поверхности водоемов пленку, легкие фракции растворяются в воде, тяжелые оседают на дне водоемов. Ядовитые компоненты нефти становятся причиной гибели гидробионтов. Основная роль в деструкции нефтепродуктов в воде принадлежит микроорганизмам -деструкторам (Di Toro et al., 2009).
Ранее считалось, что микроорганизмы, способные разлагать и использовать углеводороды нефти и нефтепродуктов, встречаются лишь там, где расположены нефтепромыслы, нефтехранилища или нефтепроводы, однако, согласно современным данным, микроорганизмы-нефтедеструкторы распространены в природе довольно обширно и могут быть выделены из любой почвы, осадочных пород, морской и речной воды. Эти гетеротрофные микроорганизмы могут усваивать различные органические соединения — углеводы, белки, жиры и пр. (Логинова О., 2011).
Способность усваивать углеводороды нефти присуща микроорганизмам, представленным разными систематическими группами. К ним относятся различные виды микромицетов, дрожжей и бактерий. Наиболее активные деструкторы нефти встречаются среди бактерий. Они характеризуются способностью к усвоению широкого спектра углеводородов, включая ароматические, обладают высокой скоростью роста и, следовательно, представляют большой практический интерес.
Углеводородокисляющая группа микроорганизмов природного происхождения таксономически довольно многообразна. Наиболее активные бактериальные штаммы относятся к родам: Pseudomonas, Arthrobacter, Rhodococcus, Acinetobacter, Flavobacterium, Corynebacterium, Xanthomonas, Alcaligenes, Nocardia, Brevibacterium, Mycobacterium, Beijerinkia, Bacillus,
Enterobacteriaceae, Klebsiella, Micrococcus, Sphaerotilus. Среди актиномицетов внимание привлекает многочисленный род Streptomyces. Из дрожжей выделяют род Candida и Torulopsis (Сидоров и др., 1997).
Целью нашего исследования явилось изучение углеводородокисляющей микрофлоры донных отложений реки Ярега (Республика Коми), загрязненных нефтью.
Для достижения поставленной цели, были поставлены следующие задачи:
1) определить общую численность основных групп микроорганизмов (сапротрофы, актиномицеты, микромицеты, углеводородокисляющие микро- организмы(У ОМ));
2) получить накопительную и чистые культуры УОМ;
3) изучить физиологические характеристики выделенных штаммов
УОМ;
4) определить диапазон pH для выделенных штаммов, а также определить оптимальные значения рН для их культивирования;
5) выделить ДНК из чистых культур и амплифицировать фрагменты гена 16S рРНК для определение видового состава;
6) оценить биотехнологический потенциал выделенных микроорганизмов.
1. Определили численность основных групп микроорганизмов:
• мезофильных микромицетов и актиномицетов составила 1,5*105
КОЕ/г, термотолерантных >1 105 КОЕ/г,
• мезофильных сапротрофов - 5*105 КОЕ/г, термотолерантных 1* 105 КОЕ/г
• психротолерантных, мезофильных и термотолерантных УОМ составила >1 * 108 КОЕ/г;
• Психротолерантные представители для микромицетов, актиномицетов и сапротрофов на 3 и 4 разведении не выявлены.
2. Выделили четыре чистые культуры УОМ (1Н - 4Н);
3. Изучили способность к росту на разных температурах для выделенных штаммов (у штаммов 1H и 3Н оптимум составил 20 оС, у штамма 2Н - оптимум в диапазоне от 20 до 37 оС, для штамма 4Н оптимум находился в диапазоне от 15 до 25 оС).
4. Определили диапазон показателей pH для роста штаммов 1Н - 4Н: все штаммы показали способность к росту в диапазоне рН от 4,5 до 9,5. Оптимальные значения рН (на основе определения численности) для штаммов 1Н и 4Н отмечены в диапазоне pH 4,5 - 8,5; Для штамма 2Н в диапазоне рН 6,5 - 9.5; Штамм 3Н на pH 5,5 - 8,5.
5. Определили филогенетическая принадлежность для штамма 2Н; анализ гена 16S рРНК показал близкое родство штамма с денитрифицирующими бактериями Pseudomonas xanthomarina и Pseudomonas stutzeri.
6. Для дальнейших исследований и использовании в биотехнологии очистки от нефтяных загрязнений наиболее перспективным является штамм 2Н, так как не является патогенным.
