ФЕНОТИПИЧЕСКИЙ СОСТАВ, ТРАНСКРИПЦИОННЫЙ ПРОФИЛЬ И ПРОГНОСТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ ОПУХОЛЕВЫХ ГИБРИДНЫХ КЛЕТОК ПРИ НЕМЕЛКОЛЕТОЧНОМ РАКЕ ЛЕГКОГО
|
АННОТАЦИЯ 3
ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, СИМВОЛОВ, СОКРАЩЕНИЙ, ТЕРМИНОВ 4
ВВЕДЕНИЕ 5
1 Обзор литературы 8
1.1 Общие сведения о раке и его значимость 8
1.2 Статистика заболеваемости и смертности 8
1.3 Характеристика и классификация НМРЛ 10
1.4 Гетерогенность опухоли при НМРЛ 12
1.5 Роль микроокружения опухоли 13
1.6 Эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП) 15
1.6.1 От открытия ЭМП к пониманию его роли в прогрессировании НМРЛ 16
1.6.2 Механизмы и характеристика ЭМП 17
1.6.2 ЭМП и терапевтическая устойчивость 18
1.7 Опухолевые гибридные клетки (ОГК) 20
1.7.1 Формирование гибридных клеток опухоли: факторы и механизмы 21
1.7.2 Слияние раковых клеток с другими клетками 23
1.7.3 Роль ОГК в метастазах 24
1.7.4 Роль ОГК в лекарственной устойчивости 26
1.7.5 Нерешённые проблемы и перспективы исследования ОГК 27
2 Материалы и методы 29
2.1 Материал исследования 29
2.2 Методы исследования 30
2.2.1 Метод приготовления клеточной суспензии 30
2.2.2 Проточная цитофлуориметрия образцов 30
2.2.3 Секвенирование РНК единичных клеток 32
2.2.4 Биоинформатическая обработка и статистический анализ данных 33
3 Результаты и обсуждение 35
3.1 Популяционный и количественный состав ОГК при НМРЛ 35
3.2 Прогностическая значимость ОГК при НМРЛ: риск метастазирования и
рецидивирования 37
3.3 Транскрипционный профиль клеточных популяций опухоли при НМРЛ 41
3.4 Идентификация ключевых генов, ассоциированных с рисками метастазирования,
рецидивирования и выживаемости при НМРЛ, на основе анализа популяционного и количественного состава опухолевых гибридных клеток 46
3.5 Обсуждение 49
ВЫВОДЫ 52
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 53
ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, СИМВОЛОВ, СОКРАЩЕНИЙ, ТЕРМИНОВ 4
ВВЕДЕНИЕ 5
1 Обзор литературы 8
1.1 Общие сведения о раке и его значимость 8
1.2 Статистика заболеваемости и смертности 8
1.3 Характеристика и классификация НМРЛ 10
1.4 Гетерогенность опухоли при НМРЛ 12
1.5 Роль микроокружения опухоли 13
1.6 Эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП) 15
1.6.1 От открытия ЭМП к пониманию его роли в прогрессировании НМРЛ 16
1.6.2 Механизмы и характеристика ЭМП 17
1.6.2 ЭМП и терапевтическая устойчивость 18
1.7 Опухолевые гибридные клетки (ОГК) 20
1.7.1 Формирование гибридных клеток опухоли: факторы и механизмы 21
1.7.2 Слияние раковых клеток с другими клетками 23
1.7.3 Роль ОГК в метастазах 24
1.7.4 Роль ОГК в лекарственной устойчивости 26
1.7.5 Нерешённые проблемы и перспективы исследования ОГК 27
2 Материалы и методы 29
2.1 Материал исследования 29
2.2 Методы исследования 30
2.2.1 Метод приготовления клеточной суспензии 30
2.2.2 Проточная цитофлуориметрия образцов 30
2.2.3 Секвенирование РНК единичных клеток 32
2.2.4 Биоинформатическая обработка и статистический анализ данных 33
3 Результаты и обсуждение 35
3.1 Популяционный и количественный состав ОГК при НМРЛ 35
3.2 Прогностическая значимость ОГК при НМРЛ: риск метастазирования и
рецидивирования 37
3.3 Транскрипционный профиль клеточных популяций опухоли при НМРЛ 41
3.4 Идентификация ключевых генов, ассоциированных с рисками метастазирования,
рецидивирования и выживаемости при НМРЛ, на основе анализа популяционного и количественного состава опухолевых гибридных клеток 46
3.5 Обсуждение 49
ВЫВОДЫ 52
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 53
Рак лёгких является одной из ведущих причин онкологической заболеваемости и смертности в мире. Согласно данным глобальной статистики, в 2023 году рак лёгкого составил около 12,4 % всех новых случаев рака, что делает его наиболее распространённым видом злокачественных новообразований. Немелкоклеточный рак лёгкого (НМРЛ), составляет около 85 % всех случаев рака лёгкого, а аденокарцинома (АК) и
плоскоклеточный рак (ПРЛ) являются наиболее частыми гистологическими подтипами [The 2021 WHO Classification of Lung Tumors ., 2022].
Развитие НМРЛ связано с рядом молекулярных и клеточных механизмов, способствующих инвазии, метастазированию и устойчивости к терапии. Одним из таких малоизученных, но перспективных явлений является процесс клеточного слияния, приводящий к образованию опухолевых гибридных клеток (ОГК). Гибридные клетки формируются в результате объединения двух или более клеток - как опухолевых между собой, так и опухолевых со стромальными. Такие ОГК демонстрируют повышенную пролиферативную активность, снижение уровня апоптоза, усиление инвазивных и миграционных свойств, а также приобретают устойчивость к химиотерапии и способны ускользать от иммунного надзора [Fusion of HepG2 Cells with..., 2014 ; Zhang et al., 2019a ; Cell Fusion Potentiates Tumor..., 2018].
В последние годы всё больше экспериментальных данных указывают на участие ОГК в метастазировании и рецидивировании опухоли, предполагая их значимость в прогрессировании заболевания [Myeloid-like tumor hybrid cells., 2023 ; Colorectal cancer stem cells., 2022]. Однако фенотипическая и транскрипционная гетерогенность этих клеток изучена недостаточно. На сегодняшний день большинство исследований сосредоточены на моделях in vitro, и подавляющее число наблюдений относится к ОГК, происходящим от макрофагов.
Идентификация ОГК на основе маркеров родительских клеток ограничена, поскольку не все гибридные клетки сохраняют исходные антигенные или молекулярные особенности [Interrelation between Polyploidization..., 2007]. Это создаёт запрос на поиск универсальных критериев и молекулярных сигнатур, которые позволили бы эффективно идентифицировать такие клетки и оценить их роль в канцерогенезе. Благодаря развитию одноклеточных «омиксных» технологий, включая секвенирование РНК единичных клеток, стало возможным детально изучить транскрипционный профиль редких клеточных популяций, в том числе и ОГК, а также выявить функционально значимые генетические и эпигенетические особенности, связанные с их биологическим поведением.
Таким образом, анализ фенотипического состава и транскрипционного профиля ОГК является важной областью исследования, способной помочь в понимании механизмов развития рецидивов и метастазирования при НМРЛ и улучшении прогнозирования клинического исхода.
Цель: определить фенотипический и транскрипционный профиль опухолевых гибридных клеток при немелкоклеточном раке легкого и оценить их прогностическую значимость для метастазирования, рецидивирования и выживаемости пациентов.
Задачи:
1. Определить популяционный и количественный состав опухолевых гибридных клеток у пациентов с немелкоклеточным раком легкого.
2. Оценить прогностическую значимость опухолевых гибридных клеток в контексте риска метастазирования и рецидивирования немелкоклеточного рака легкого.
3. Провести транскрипционный анализ клеточных популяций опухоли при НМРЛ методом секвенирования РНК единичных клеток с целью выявления ключевых генетических маркеров, ассоциированных с функциональной активностью и вкладом клеток в прогрессирование заболевания.
4. На основе данных о популяционном и количественном составе опухолевых
гибридных клеток выявить ключевые гены, ассоциированные с рисками
метастазирования, рецидивирования и выживаемости пациентов с немелкоклеточным раком легкого.
Данное исследование выполнено в Лаборатории биологии опухолевой прогрессии Научно-исследовательского института онкологии Томского научно-исследовательского медицинского центра (НИИ онкологии Томского НИМЦ).
Автор выражает благодарность:
• Меняйло М. Е., канд. мед. наук - научному руководителю исследования, за методическое руководство, поддержку и ценную экспертную оценку на всех этапах работы;
• Федорову А. А., канд. мед. наук - за помощь в проведении экспериментальной части исследования и обсуждение полученных данных;
• Хозяиновой А. А., мл. науч. сотр. - за техническую поддержку и помощь в биоинформационной обработке данных scRNA-seq.
Особая благодарность - заведующему лабораторией Денисову Е. В., д-р биол. наук, за предоставленные ресурсы, возможность использования современного оборудования и научное сопровождение проекта.
плоскоклеточный рак (ПРЛ) являются наиболее частыми гистологическими подтипами [The 2021 WHO Classification of Lung Tumors ., 2022].
Развитие НМРЛ связано с рядом молекулярных и клеточных механизмов, способствующих инвазии, метастазированию и устойчивости к терапии. Одним из таких малоизученных, но перспективных явлений является процесс клеточного слияния, приводящий к образованию опухолевых гибридных клеток (ОГК). Гибридные клетки формируются в результате объединения двух или более клеток - как опухолевых между собой, так и опухолевых со стромальными. Такие ОГК демонстрируют повышенную пролиферативную активность, снижение уровня апоптоза, усиление инвазивных и миграционных свойств, а также приобретают устойчивость к химиотерапии и способны ускользать от иммунного надзора [Fusion of HepG2 Cells with..., 2014 ; Zhang et al., 2019a ; Cell Fusion Potentiates Tumor..., 2018].
В последние годы всё больше экспериментальных данных указывают на участие ОГК в метастазировании и рецидивировании опухоли, предполагая их значимость в прогрессировании заболевания [Myeloid-like tumor hybrid cells., 2023 ; Colorectal cancer stem cells., 2022]. Однако фенотипическая и транскрипционная гетерогенность этих клеток изучена недостаточно. На сегодняшний день большинство исследований сосредоточены на моделях in vitro, и подавляющее число наблюдений относится к ОГК, происходящим от макрофагов.
Идентификация ОГК на основе маркеров родительских клеток ограничена, поскольку не все гибридные клетки сохраняют исходные антигенные или молекулярные особенности [Interrelation between Polyploidization..., 2007]. Это создаёт запрос на поиск универсальных критериев и молекулярных сигнатур, которые позволили бы эффективно идентифицировать такие клетки и оценить их роль в канцерогенезе. Благодаря развитию одноклеточных «омиксных» технологий, включая секвенирование РНК единичных клеток, стало возможным детально изучить транскрипционный профиль редких клеточных популяций, в том числе и ОГК, а также выявить функционально значимые генетические и эпигенетические особенности, связанные с их биологическим поведением.
Таким образом, анализ фенотипического состава и транскрипционного профиля ОГК является важной областью исследования, способной помочь в понимании механизмов развития рецидивов и метастазирования при НМРЛ и улучшении прогнозирования клинического исхода.
Цель: определить фенотипический и транскрипционный профиль опухолевых гибридных клеток при немелкоклеточном раке легкого и оценить их прогностическую значимость для метастазирования, рецидивирования и выживаемости пациентов.
Задачи:
1. Определить популяционный и количественный состав опухолевых гибридных клеток у пациентов с немелкоклеточным раком легкого.
2. Оценить прогностическую значимость опухолевых гибридных клеток в контексте риска метастазирования и рецидивирования немелкоклеточного рака легкого.
3. Провести транскрипционный анализ клеточных популяций опухоли при НМРЛ методом секвенирования РНК единичных клеток с целью выявления ключевых генетических маркеров, ассоциированных с функциональной активностью и вкладом клеток в прогрессирование заболевания.
4. На основе данных о популяционном и количественном составе опухолевых
гибридных клеток выявить ключевые гены, ассоциированные с рисками
метастазирования, рецидивирования и выживаемости пациентов с немелкоклеточным раком легкого.
Данное исследование выполнено в Лаборатории биологии опухолевой прогрессии Научно-исследовательского института онкологии Томского научно-исследовательского медицинского центра (НИИ онкологии Томского НИМЦ).
Автор выражает благодарность:
• Меняйло М. Е., канд. мед. наук - научному руководителю исследования, за методическое руководство, поддержку и ценную экспертную оценку на всех этапах работы;
• Федорову А. А., канд. мед. наук - за помощь в проведении экспериментальной части исследования и обсуждение полученных данных;
• Хозяиновой А. А., мл. науч. сотр. - за техническую поддержку и помощь в биоинформационной обработке данных scRNA-seq.
Особая благодарность - заведующему лабораторией Денисову Е. В., д-р биол. наук, за предоставленные ресурсы, возможность использования современного оборудования и научное сопровождение проекта.
1. Установлен популяционный состав опухолевых гибридных клеток у пациентов с немелкоклеточным раком легкого. В тканях опухоли выявлено 6 основных популяций и 84 субпопуляции ОГК, характеризующихся экспрессией маркерных генов, ассоциированных с лейкоцитами, макрофагами, фибробластами и стволовыми клетками.
2. Установлена прогностическая значимость ОГК в зависимости от их фенотипа. У
пациентов с гематогенными метастазами наблюдалось увеличение числа ОГК с признаками стволовости и лейкоцитов (pan-CK+EpCAM+CD45+CD44+, pan-
CK+CD45+CD73+), также с признаками стволовости и макрофагов
(EpCAM+CD45+CD44+CD73+CD163+, pan-CK+CD45+CD73+CD68+). У пациентов с локорегионарными рецидивами выявлена повышенная частота ОГК с маркерами макрофагов (pan-CK+CD45+CD163+, pan-CK+CD45+CD68+), а также ОГК с
признаками стволовости и лейкоцитов, макрофагов (pan-CK+CD45+CD44+CD73+, pan-CK+CD45+CD44+CD68+).
3. Выполнен детальный анализ транскрипционного профиля опухолевых клеток
методом секвенирования РНК единичных клеток. Идентифицированы ключевые генетические маркеры, вовлечённые в онкогенез НМРЛ: LINC02582, LINC00393, SGIP1, VSNL1, CDK6, RBP1, ESRRG, RNF217-AS1, AL137800.1, NREP. Особое значение имеет ген CDK6, играющий важную роль в пролиферации и
прогрессировании опухоли.
4. На основе анализа фенотипического и транскрипционного профилей ОГК выявлены ключевые гены, связанные с клиническими исходами. Ген SRGN был связан с высоким риском метастазирования. Также показана потенциальная роль BCL2A1 и SPP1 в регуляции выживания опухолевых клеток. Эти гены могут рассматриваться как возможные маркеры прогноза у пациентов с НМРЛ.
2. Установлена прогностическая значимость ОГК в зависимости от их фенотипа. У
пациентов с гематогенными метастазами наблюдалось увеличение числа ОГК с признаками стволовости и лейкоцитов (pan-CK+EpCAM+CD45+CD44+, pan-
CK+CD45+CD73+), также с признаками стволовости и макрофагов
(EpCAM+CD45+CD44+CD73+CD163+, pan-CK+CD45+CD73+CD68+). У пациентов с локорегионарными рецидивами выявлена повышенная частота ОГК с маркерами макрофагов (pan-CK+CD45+CD163+, pan-CK+CD45+CD68+), а также ОГК с
признаками стволовости и лейкоцитов, макрофагов (pan-CK+CD45+CD44+CD73+, pan-CK+CD45+CD44+CD68+).
3. Выполнен детальный анализ транскрипционного профиля опухолевых клеток
методом секвенирования РНК единичных клеток. Идентифицированы ключевые генетические маркеры, вовлечённые в онкогенез НМРЛ: LINC02582, LINC00393, SGIP1, VSNL1, CDK6, RBP1, ESRRG, RNF217-AS1, AL137800.1, NREP. Особое значение имеет ген CDK6, играющий важную роль в пролиферации и
прогрессировании опухоли.
4. На основе анализа фенотипического и транскрипционного профилей ОГК выявлены ключевые гены, связанные с клиническими исходами. Ген SRGN был связан с высоким риском метастазирования. Также показана потенциальная роль BCL2A1 и SPP1 в регуляции выживания опухолевых клеток. Эти гены могут рассматриваться как возможные маркеры прогноза у пациентов с НМРЛ.