📄Работа №191289
Тема: ЦИТОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ УРОВНЕЙ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ-МАРКЕРОВ Ml / М2 ФЕНОТИПОВ МИКРОГЛИИ В ПЕРВИЧНОЙ КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК МОЗГА МЫШИ
Характеристики работы
Тип работы
Бакалаврская работа
Предмет
Биология
Объем:
63 листов
Год:
2023
Просмотров:
54
4375
руб.
🛒 Купить работу
Не подходит эта работа?
Закажите новую по вашим требованиям
Узнать цену на написание
Закажите новую по вашим требованиям
Представленный материал является образцом учебного исследования, примером структуры и содержания учебного исследования по заявленной теме. Размещён исключительно в информационных и ознакомительных целях.
Workspay.ru оказывает информационные услуги по сбору, обработке и структурированию материалов в соответствии с требованиями заказчика.
Размещение материала не означает публикацию произведения впервые и не предполагает передачу исключительных авторских прав третьим лицам.
Материал не предназначен для дословной сдачи в образовательные организации и требует самостоятельной переработки с соблюдением законодательства Российской Федерации об авторском праве и принципов академической добросовестности.
Авторские права на исходные материалы принадлежат их законным правообладателям. В случае возникновения вопросов, связанных с размещённым материалом, просим направить обращение через форму обратной связи.
Настоящий учебно-методический информационный материал размещён в ознакомительных и исследовательских целях и представляет собой пример учебного исследования. Не является готовым научным трудом и требует самостоятельной переработки.
📋 Содержание
АННОТАЦИЯ 2
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 6
ВВЕДЕНИЕ 7
1 Обзор литературы 9
1.1 Общая характеристика клеток ЦНС 9
1.2 Общая характеристика резидентных макрофагов ЦНС 9
1.3 Функции микроглии 12
1.3.1 Функции микроглии на разных стадиях развития ЦНС 12
1.3.2 Фагоцитарная активность микроглии 13
1.3.3 Микроглия при нейровоспалении 14
1.4 Локализация макрофагов в ЦНС и их морфология 15
1.5 M0, M1 и M2 фенотипы микроглии 16
1.6 Маркеры фенотипа M1 и M2 микроглии 19
1.7 Модели для изучения микроглии 20
1.7.1 Культура первичных диссоциированных клеток ЦНС 21
1.7.2 Линии клеток микроглии 25
1.7.3 Клеточные линии микроглии, полученные из стволовых клеток 25
1.8 Изменение экспрессии генов микроглии при культивировании in vitro 26
2 Материалы и методы 28
2.1 Объект исследования 28
2.2 Дизайн эксперимента 28
2.3 Получение первичной смешанной культуры клеток нервной ткани 30
2.4 Культивирование первичной смешанной культуры клеток нервной ткани 31
2.5 Выделение тотальной РНК 31
2.6 Иммуноокрашивание и микроскопирование 32
2.7 Синтез кДНК 33
2.8 Полимеразная цепная реакция в реальном времени (real-time PCR) 34
2.9 Статистический анализ 35
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 50
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 6
ВВЕДЕНИЕ 7
1 Обзор литературы 9
1.1 Общая характеристика клеток ЦНС 9
1.2 Общая характеристика резидентных макрофагов ЦНС 9
1.3 Функции микроглии 12
1.3.1 Функции микроглии на разных стадиях развития ЦНС 12
1.3.2 Фагоцитарная активность микроглии 13
1.3.3 Микроглия при нейровоспалении 14
1.4 Локализация макрофагов в ЦНС и их морфология 15
1.5 M0, M1 и M2 фенотипы микроглии 16
1.6 Маркеры фенотипа M1 и M2 микроглии 19
1.7 Модели для изучения микроглии 20
1.7.1 Культура первичных диссоциированных клеток ЦНС 21
1.7.2 Линии клеток микроглии 25
1.7.3 Клеточные линии микроглии, полученные из стволовых клеток 25
1.8 Изменение экспрессии генов микроглии при культивировании in vitro 26
2 Материалы и методы 28
2.1 Объект исследования 28
2.2 Дизайн эксперимента 28
2.3 Получение первичной смешанной культуры клеток нервной ткани 30
2.4 Культивирование первичной смешанной культуры клеток нервной ткани 31
2.5 Выделение тотальной РНК 31
2.6 Иммуноокрашивание и микроскопирование 32
2.7 Синтез кДНК 33
2.8 Полимеразная цепная реакция в реальном времени (real-time PCR) 34
2.9 Статистический анализ 35
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 50
📖 Введение
Резидентные макрофаги ЦНС - микроглия - при различных патологиях может проявлять как нейропротекторные так и нейродеструктивные свойства, соответственно обладать противовоспалительным (фенотип М2) и провоспалительным (фенотип М1) действием. Она играет роль в патогенезе различных заболеваний и может являться перспективной мишенью для снижения цитотоксичности нейровоспаления и коррекции нейродегенерации [Garden, Moller, 2006; Role of microglia in central ..., 2004; Subramaniam, Federoff, 2017; CX3CR1 deficiency ..., 2014]. Например, в качестве терапевтической стратегии при заболеваниях ЦНС предложено воздействие на фагоцитирующую функцию микроглии [Phagocytosis of microglia ..., 2014]. В ЦНС были описаны микроглиоциты разной морфологии - фенотип М0, характерный для микроглии в мозге без патологий, М1 фенотип с характерной амебоидной морфологией и фагоцитозно активный фенотип, предположительно М2 фенотип [Luo, Chen, 2012 ; Nayak et al., 2014]. Показано, что первой реакцией микроглии на поражение ЦНС является изменение фенотипа от М0 к М2 - нейропротекторному, в отличие от изменения фенотипа микроглии от М0 к М1 у системных макрофагов [Tang, Le, 2016 ; Microglia/macrophage polarization dynamics ..., 2015].
Использование клеточных линий для анализа реакции клеток на различные воздействия является актуальным направлением в биологии. Особенно перспективно это направление в нейробиологии, где прямое вмешательство в работу мозга чревато непоправимыми изменениями на уровне всего организма. Использование клеточной культуры микроглиоцитов для воссоздания моделей заболеваний на животных позволит расширить подходы в изучении различных патологий и реакции на них иммунных клеток.
В настоящее время разработаны протоколы для генерации микроглии из эмбриональных стволовых клеток мышей и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека. Однако предлагаемые в них способы требуют больших затрат и пока не до конца известно, насколько правильно и адекватно полученные таким образом клетки репрезентуют свойства микроглии [Characterization of inflammatory ..., 2016 ; Human primary bone ..., 2017 ; Efficient derivation ..., 2016]. Поэтому, несмотря на существование таких методик как потенциального инструмента для изучения микроглии, до сих пор остаются актуальными более простые протоколы выделения и культивирования клеток микроглии из мозга грызунов. Одним из подходов, используемых для изучения микроглии, является получение первичных клеточных культур из мозга грызунов. В первичной культуре клеток присутствует наиболее полный клеточный состав, характерный для данной ткани. У клеток сохраняется возможность взаимодействовать друг с другом в пределах эксплантатов, поэтому можно предположить, что первичные клеточные культуры могут быть более адекватной моделью для тех исследований, где важно сохранение взаимодействия между клетками. Также из-за непродолжительного периода культивирования первичных культур, в клетках не успевают произойти изменения, характерные для иммортализованных линий. С другой стороны, при выделении и на начальных этапах культивирования первичной культуры клеток мозга происходит резкое изменение химического состава окружающей среды, разрушение тканевой структуры, потеря контактов между клетками, массовая гибель клеток. Все эти негативные факторы приводят к изменению морфологии клеток, к частичному или полному изменению выполняемых функций, а значит - изменению транскриптома клеток. Для описания изменений, которые происходят с клетками при переводе их в культуру, необходим как анализ изменения их морфологии, так и анализ изменения экспрессии их генов.
Целью работы является цитологический анализ и определение уровней экспрессии генов - маркеров М1 и M2 фенотипов микроглии в первичной культуре клеток мозга мыши.
В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:
1. Провести цитологический анализ Iba1+ клеток в мозге мышей постнатального возраста (Р1 - 2).
2. Провести цитологический анализ Iba1+ клеток в первичной культуре клеток, выделенных из мозга мышей Р1 - 2 возраста и зафиксированных через 6 часов, 1 день, 3 дня, 7 и 14 дней после начала культивирования in vitro.
3. Получить данные по профилям экспрессии генов - маркеров фенотипов М1 (CD86)и М2 (CD206, ARG!)в первичной культуре клеток мозга на 3 и 14 день после начала культивирования in vitro.
Работа была выполнена в лаборатории нейробиологии и лаборатории экологии, генетики и охраны окружающей среды НИИ ББ ТГУ.
Использование клеточных линий для анализа реакции клеток на различные воздействия является актуальным направлением в биологии. Особенно перспективно это направление в нейробиологии, где прямое вмешательство в работу мозга чревато непоправимыми изменениями на уровне всего организма. Использование клеточной культуры микроглиоцитов для воссоздания моделей заболеваний на животных позволит расширить подходы в изучении различных патологий и реакции на них иммунных клеток.
В настоящее время разработаны протоколы для генерации микроглии из эмбриональных стволовых клеток мышей и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека. Однако предлагаемые в них способы требуют больших затрат и пока не до конца известно, насколько правильно и адекватно полученные таким образом клетки репрезентуют свойства микроглии [Characterization of inflammatory ..., 2016 ; Human primary bone ..., 2017 ; Efficient derivation ..., 2016]. Поэтому, несмотря на существование таких методик как потенциального инструмента для изучения микроглии, до сих пор остаются актуальными более простые протоколы выделения и культивирования клеток микроглии из мозга грызунов. Одним из подходов, используемых для изучения микроглии, является получение первичных клеточных культур из мозга грызунов. В первичной культуре клеток присутствует наиболее полный клеточный состав, характерный для данной ткани. У клеток сохраняется возможность взаимодействовать друг с другом в пределах эксплантатов, поэтому можно предположить, что первичные клеточные культуры могут быть более адекватной моделью для тех исследований, где важно сохранение взаимодействия между клетками. Также из-за непродолжительного периода культивирования первичных культур, в клетках не успевают произойти изменения, характерные для иммортализованных линий. С другой стороны, при выделении и на начальных этапах культивирования первичной культуры клеток мозга происходит резкое изменение химического состава окружающей среды, разрушение тканевой структуры, потеря контактов между клетками, массовая гибель клеток. Все эти негативные факторы приводят к изменению морфологии клеток, к частичному или полному изменению выполняемых функций, а значит - изменению транскриптома клеток. Для описания изменений, которые происходят с клетками при переводе их в культуру, необходим как анализ изменения их морфологии, так и анализ изменения экспрессии их генов.
Целью работы является цитологический анализ и определение уровней экспрессии генов - маркеров М1 и M2 фенотипов микроглии в первичной культуре клеток мозга мыши.
В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:
1. Провести цитологический анализ Iba1+ клеток в мозге мышей постнатального возраста (Р1 - 2).
2. Провести цитологический анализ Iba1+ клеток в первичной культуре клеток, выделенных из мозга мышей Р1 - 2 возраста и зафиксированных через 6 часов, 1 день, 3 дня, 7 и 14 дней после начала культивирования in vitro.
3. Получить данные по профилям экспрессии генов - маркеров фенотипов М1 (CD86)и М2 (CD206, ARG!)в первичной культуре клеток мозга на 3 и 14 день после начала культивирования in vitro.
Работа была выполнена в лаборатории нейробиологии и лаборатории экологии, генетики и охраны окружающей среды НИИ ББ ТГУ.
ИЛИ
Поиск аналога
📕 Список литературы
🛒 Оформить заказ
⚡ Работу высылаем в течении 5 минут после оплаты.