Аннотация
ВВЕДЕНИЕ 4
1 Литературный обзор 6
1.1 Нефть и проблема загрязнения нефтепродуктами 6
1.1.1 Нефть и основные фракции нефти 6
1.1.2 Экологическая проблема загрязнения нефтепродуктами 7
1.1.3 Бактерии, способные к биодеградации нефти 9
1.1.4 Консорциумы микроорганизмов-деструкторов углеводородов 10
1.2 Консорциум микроорганизмов-деструкторов углеводородов «Абориген» 12
1.2.1 Штаммы, входящие в консорциум «Абориген», и их микробиологическая
характеристика 12
1.2.2 Эффективность биодеградации углеводородов нефти консорциумом «Абориген» ...13
1.3 Ферменты биодеградации углеводородов 14
1.3.1 Ферменты, ответственные за биодеградацию парафиновой (алкановой) фракции
нефтепродуктов 14
1.3.2 Ферменты, ответственные за биодеградацию ареновой фракции нефтепродуктов ....16
1.3.3 Ферменты, ответственные за биодеградацию асфальтеновой фракции
нефтепродуктов 17
1.3.4 Пути метаболизма нафталина 18
2 Материалы и методы исследования 20
2.1 Культивирование штаммов, ответственных за биодеградацию углеводородов 20
2.2 Метод выделения плазмидной ДНК 20
2.3 Метод выделения бактериальной ДНК 20
2.4 Гель-электрофорез 21
2.5 Метод полимеразной цепной реакции для поиска генов ферментов участвующих в
биодеградации углеводородов 21
3 Результаты и обсуждение 23
3.1 Поиск ферментов, ответственных за биодеградацию углеводородов 23
3.2 Культивирование штаммов консорциума «Абориген» 24
3.3 Выделение бактериальной и плазмидной ДНК из шести штаммов консорциума
«Абориген» B-1316, LZ-1e, B1317, B1318, 2H, B10 25
3.4 Очистка выделенной бактериальной ДНК из штаммов консорциума «Абориген» B-
1316, LZ-1e, B1317, B1318, 2H, B10 с помощью метода выделения из геля 25
3.6 Анализ наличия нуклеотидной последовательности ферментов участвующих в
деградации нефтепродуктов CatA, NahH, AlkB, ChnA-1, NpcB, NphA1, PhbH, Edo, BphC, BphA4 в бактериальной и плазмидной ДНК, выделенных из штаммов консорциума «Абориген» B1316, Lz-1e, B1317 26
3.5 Анализ наличия нуклеотидной последовательности ферментов участвующих в метаболизме нафталина Ndo, Sal, Pht3, OphA1A2, NidA, NidB в бактериальной и
плазмидной ДНК, выделенных из шести штаммов консорциума «Абориген» 30
ВЫВОДЫ 33
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 34
Миллионы тонн жидких и твердых отходов ежегодно образуются в результате деятельности нефтяной и нефтеперерабатывающей промышленности. Места хранения таких отходов представляют серьезную опасность для окружающей среды, а многочисленные аварии при добыче, переработке и транспортировке нефти и нефтепродуктов являются причиной масштабных загрязнений природных объектов. При этом самоочищение загрязненных территорий без вмешательства человека длится десятки лет. Способность микроорганизмов к трансформации или деградации углеводородов нефти хорошо известна и позволяет использовать для биоремедиации загрязненных территорий. В связи с чем возникает необходимость в поиске конкретных ферментов, отвечающих за деградацию нефтепродуктов.
За прошедшие десятилетия изучения биодеградации нефти хорошо исследована деградация линейных и разветвленных углеводородов, а также аренов с пятью и менее ароматическими кольцами в составе молекулы (Lafortune et al., 2009). При этом способность к биодеградации смол и асфальтенов остается малоизученной (Harayama et al., 1999).
Ученые Биологического института Томского госуниверситета совместно с Группой компаний «Дарвин» разработали препарат «Абориген» для биологической очистки водоёмов от нефти. В основе препарата - углеводородокисляющие микроорганизмы, которые используют нефтепродукты в качестве источника пищи и энергии и окисляют их, разлагая до нетоксичных веществ. Так как эти микроорганизмы выделены в северных районах, они устойчивы к сложным климатическим условиям, что делает работу по поиску ферментов более актуальной.
Цель: поиск ферментов, ответственных за биодеградацию углеводородов, и, в частности, в метаболизме нафталина в штаммах консорциума микроорганизмов «Абориген»
Задачи:
1. Наработка клеточной массы штаммов консорциума «Абориген» B-1316, LZ- 1e, B1317, B1318, 2H, B10, ответственных за биодеградацию нефти для получения чистой бактериальной и плазмидной ДНК
2. Выделение чистой бактериальной и плазмидной ДНК из штаммов консорциума «Абориген»
3. На основе литературных данных подбор оптимальных праймеров для поиска ферментов, участвующих в деградации различных фракций нефти методом ПЦР.
4. Анализ наличия нуклеотидной последовательности ферментов участвующих в деградации нефтепродуктов CatA, NahH, AlkB, ChnA-1, NpcB, NphA1, PhbH, Edo, Bph, BphC, BphA4 в бактериальной и плазмидной ДНК, выделенных из штаммов консорциума «Абориген» B1316, Lz-1e, B1317.
5. Анализ наличия нуклеотидной последовательности ферментов участвующих
в метаболизме нафталина Ndo, Sal, Pht3, OphA1A2, NidA, NidB в бактериальной и плазмидной ДНК, выделенных из шести штаммов консорциума «Абориген».
1. В результате культивирования шести бактериальных штаммов консорциума «Абориген» B-1316, LZ-1e, B1317, B1318, 2H, B10 на среде с добавлением и без добавления нефтепродуктов, с использованием методов выделения плазмидной и геномной ДНК и методов очистки в агарозном геле были получены чистые фракции плазмидной и бактериальной ДНК для шести штаммов консорциума «Абориген».
2. Выполнен анализ наличия нуклеотидной последовательности ферментов участвующих в деградации нефтепродуктов в бактериальной и плазмидной ДНК, выделенных из штаммов консорциума «Абориген» B1316, Lz-1e, B1317. Показано, что штамм В1316 содержит четыре фермента ответственных за биодеградацию фракции аренов, два фермента парафинов и один фермент асфальтенов. Штамм Lz-1e содержит 5 ферментов участвующих в разложении аренов и по одному на фракции парафинов и асфальтенов. Штамм В1317 имеет 7 ферментов участвующих в биодеградации аренов и по одному ферменту ответственному за асфальтены и парафины.
3. Проведен анализ наличия нуклеотидной последовательности ферментов участвующих в метаболизме нафталина в бактериальной и плазмидной ДНК шести штаммов консорциума «Абориген». Показано, что только в плазмидной ДНК штаммов LZ- 1e, B1318 и B10 выявлены гены ферментов, участвующих в биодеградации нафталина. Все три штамма способны к разложению нафталина по офталевому пути и только штамм В1318 способен к биодеградации по сацилатовому пути.
