ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТАТУСА ИНАКТИВАЦИИ Х-ХРОМОСОМЫ С НЕСБАЛАНСИРОВАННЫМИ ХРОМОСОМНЫМИ МУТАЦИЯМИ У ЖЕНЩИН- НОСИТЕЛЬНИЦ И ИХ СПОНТАННЫХ АБОРТУСОВ

АННОТАЦИЯ 3
ВВЕДЕНИЕ 2
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 6
1.1 Инактивация X-хромосомы 6
1.1.1. Особенности Х-хромосомы, определение инактивации 6
1.1.2 Механизм процесса инактивации 8
1.1.3 Значение в эволюции 10
1.1.4 Типы инактиваций 12
1.1.5 Г ены, избегающие инактивации Х-хромосомы 15
1.2 Эффекты смещения инактивации Х-хромосомы 16
1.1.1 Связь с возрастом 16
1.1.2 Канцерогенез 17
1.1.3 Понятие Х-сцепленных мутаций - моногенные, хромосомные и геномные 19
1.1.4 CNV как одна из возможных причин sXCI 21
2.2 Методы 25
2.2.1 Выделение ДНК из крови микрометодом 25
2.2.2 Спектрофотометрическое определение концентрации ДНК 26
2.2.3 Электро форез полученной ДНК 26
2.2.4 Таргетное секвенирование генов XIST и XACT 26
2.2.5 Бисульфитная модификация ДНК 28
2.2.6 Таргетная полимеразная цепная реакция (ПЦР) на регионы Х-
хромосомы 29
ВЫВОДЫ 30
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 31
Купить

Инактивация Х-хромосомы (XCI, X chromosome inactivation) у женщин - процесс, необходимый для компенсации дозы Х-сцепленных генов. Инактивация Х-хромосомы происходит в раннем эмбриогенезе и у человека в норме имеет равновероятный характер. Асимметричная инактивация Х- хромосомы, когда преимущественно инактивируется одна из родительских хромосом, редко встречается в общей популяции, но бывает ассоциирована с различными заболеваниями и отклонениями развития (умственная отсталость, аутизм, синдром Барта), в том числе и с невынашиванием беременности.
Возможно, что вариации числа копий участков ДНК или несбалансированные микроструктурные перестройки хромосом могут быть одним из факторов, влияющим на характер инактивации Х-хромосомы, особенно в тех случаях, когда в них задействованы гены, контролирующие процессы деления и клеточной пролиферации на ранних этапах преимплантационного развития организма. Поэтому смещение XCI может служить индикатором наличия структурных хромосомных мутаций, или других генетических вариантов (CNVs) на Х-хромосоме [45]. Тем не менее, подтверждение статуса инактивации именно мутантной Х-хромосомы до сих пор вызывает определенные методологические трудности.
Ранее была показана роль несбалансированных хромосомных мутаций в патогенезе спонтанного прерывания беременности - от 1 до 13% спонтанных абортусов имеют в своем кариотипе микроструктурные перестройки хромосом [8]. Но до сих пор неизвестно, микроделеции и микродупликации каких регионов Х-хромосомы у матери могут привести к гибели ее эмбриона, либо же к гибели приводят патогенные микроделеции и микродупликации, возникающие у эмбриона de novo.
Для адекватной интерпретации биологической значимости микроструктурных перестроек хромосом необходимо установить их локализацию, генный состав и статус наследования, поэтому целесообразно проводить исследования субмикроскопических хромосомных вариаций не только в клетках эмбрионов, но и у их родителей. Если смещение Х- инактивации у женщины происходит при микроструктурных перестройках на Х-хромосоме, то преимущественная инактивация такой Х-хромосомы может иметь протективный эффект на фенотип матери. В следующем поколении, если инактивация Х-хромосомы у эмбриона, либо у ребенка женского пола, окажется равновероятной, то мутация проявится и приведет к гибели зародыша, либо к рождению девочки с хромосомным заболеванием. В случае эмбриона, либо ребенка мужского пола, получившего Х-хромосому с несбалансированной структурной перестройкой, проявление мутации неизбежно.
Учитывая наличие избегающих инактивации генов на Х-хромосоме, для оценки статуса инактивации будут использоваться те CpG-сайты, которые не избегают инактивации. Для оценки статуса инактивации Х-хромосомы с микроструктурной перестройкой будет проведено бисульфитное секвенирование продуктов ПЦР внутри регионов делеции Х-хромосомы женщины. В случае обнаружения низкого уровня метилирования CpG-сайтов, которые метилируются на инактивированной хромосоме, можно будет сделать вывод о том, что активным является гомолог дикого типа.
По результатам научного задела при анализе спектра мутаций у женщин со смещением инактивации Х-хромосомы были выявлены Х-сцепленные вариации числа копий участков ДНК (CNV), которые были также подтверждены с помощью ПЦР в режиме реального времени и у спонтанных абортусов этих женщин. Определение статуса Х-хромосомы с мутацией в этих семьях послужит прямым подтверждением возникновения или отсутствия патологического фенотипа при инактивации Х-хромосом с мутацией или без, и, кроме того, послужит основанием для рассмотрения показателя смещение инактивации Х-хромосомы как возможного индикатора Х-сцепленных CNV.
Целью данного исследования является определение связи между статусом инактивации Х-хромосомы с несбалансированными хромосомными мутациями у женщин-носительниц и патологическим фенотипом у их спонтанных абортусов
Исходя из этого, были поставлены следующие задачи:
1. Идентификация мутантных вариантов в генах XIST и XACT с использованием таргетного секвенирования нового поколения у 21 женщины с sXCI
2. Определение индекса метилирования Х-хромосомы в регионе делеции Xq24 с помощью бисульфитного секвенирования нового поколения
3. Определение статуса инактивации Х-хромосомы у женщин- носительниц делеции Xq24.
Работа выполнена на базе НИИ медицинской генетики ФГБНУ Томского национального исследовательского медицинского центра РАН в лаборатории цитогенетики под руководством младшего научного сотрудника Фоновой Елизаветы Алексеевны. Автор выражает благодарность научному руководителю за помощь при написании курсовой работы.

Купить