СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ 3
ВВЕДЕНИЕ 5
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8
1.1 Инактивация Х-хромосомы и ее типы 8
1.2 Связь асимметричной инактивации Х-хромосомы
с патологиями у человека 12
1.3 Вариации числа копий участков ДНК (CNVs) 14
1.4 Роль CNVs в этиологии ранних репродуктивных потерь 16
2 МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ 24
2.1 Материал исследования 24
2.2 Выделение ДНК из крови микрометодом 24
2.3 Гидролиз ДНК метилчувствительной эндонуклеазой Hpa II 25
2.4 Амплификация локуса AR Х-хромосомы
с помощью полимеразной цепной реакции (ПТ (Р) 25
2.5 Анализ статуса инактивации с помощью
капиллярного электрофореза 26
2.6 Матричная сравнительная геномная гибридизация 26
2.6.1 Подготовка геномной ДНК 26
2.6.2 Энзиматическое мечение образцов ДНК 27
2.6.3 Очистка меченых образцов ДНК 27
2.6.4 Подготовка меченной ДНК к гибридизации 28
2.6.5 Гибридизация и отмывка 28
2.7 Классификация обнаруженных CNVs 29
2.8 Анализ обогащения 29
3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 31
ВЫВОДЫ 37
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
Невынашивание беременности является одной из ключевых проблем современной репродуктивной биологии человека и медицины. По разным оценкам, от 15 до 25 % клинически распознаваемых беременностей спонтанно прерывается на сроке до 16 недель (Macklon N. S. et al., 2002, Радзинский В. Е. и др, 2015). Причины остановки развития эмбрионов имеют многофакторную природу, однако ключевая роль в этиологии ранних репродуктивных потерь отводится генетическим факторам (Лебедев И. Н. и др., 2013). Известно, что около половины зародышей имеют числовые и структурные аномалии хромосомного набора (Griffin D. K., 1996). Причины гибели оставшейся значительной части эмбрионов, для которых с помощью стандартных цитогенетических методов был определен нормальный кариотип, часто остаются неясными. Ряд исследований указывает на то, что определенную роль в этом процессе играют нарушения эпигенетических систем реализации наследственной информации. Одним из таких процессов, влияющих на способность женщины выносить ребенка, является инактивация X-хромосомы
Инактивация Х-хромосомы (XCI) - эпигенетический процесс, при котором репрессируется одна из двух Х-хромосом клеток женского организма - необходима для компенсации дозы Х-сцепленных генов. Для человека характерна равновероятная XCI, когда каждый из гомологов инактивируется примерно в 50 % клеток организма.
Процесс инактивации Х-хромосомы происходит еще до имплантации, когда бластоциста имеет небольшие размеры. Большинство соматических тканей являются производными 15-20 клеток предшественников, из которых и состоит эпибласт, а в малоклеточных бластоцистах клеток предшественников соответственно еще меньше.
Об ассиметричной инактивации Х-хромосомы (Skewed X-chromosome inactiva-tion - sXCI) говорят в том случае, когда наблюдается смещение преимущества инактивации (> 80 %) в сторону одной из родительских хромосом, а случаи, когда активной остается менее 10 % Х-хромосом одного из родителей, считаются экстремальным смещением. В нормальной популяции смещенная инактивация Х-хромосомы встречается у 1,5-7 % здоровых женщин, тогда как у женщин с невынашиванием беременности частота sXCI может достигать 16-17 % (Sui Y. et al., 2015).
sXCI может быть результатом первичной неслучайной инактивации, как например мутации в промоторе гена XIST, ключевого для процесса инактивации (Plenge R. M. et al., 1997), однако такие мутации очень редки. Другой вариант - появление вторичной асимметрией в следствие селекции клеточных клонов, несущих какие-либо мутации на активной Х-хромосоме, от внутригенных до микроструктурных аберраций, влияющих на
жизнеспособность клетки (Толмачева Е. Н. и др., 2009). Процесс инактивации Х- хромосомы запускается на ранних этапах развития. У человека накопление транскриптов гена XIST зафиксировано уже на 8-клеточной стадии дробления (Van den Berg., 2009). Это событие совпадает по времени с активацией эмбрионального генома и началом работы контрольных точек клеточного цикла. Соответственно, в части бластомеров с хромосомными мутациями, такими, например, как моносомии, может запускаться процесс апоптоза и пул бластомеров уменьшается. Смещение инактивации Х-хромосомы в этом случае имеет стохастический характер и возникает из-за компартментализации бластомеров при раннем развитии.
Вариация числа копий (Copy number variation, CNV) — вид генетического полиморфизма, к которому относят различия индивидуальных геномов по числу копий хромосомных сегментов размером от 1 тыс. до нескольких млн. пар нуклеотидов. Сведения о CNVs, как о новом уровне соматической структурной вариабельности генома, стали накапливаться в литературе с развитием высокоразрешающих молекулярноцитогенетических технологий. CNVs возникают в результате несбалансированных хромосомных перестроек, таких как делеции и дупликации. Более 41 % CNVs
перекрываются с известными генами, что позволяет выдвинуть предположение о возможной важной роли данного типа структурной вариабельности генома в регуляции экспрессии генов.
В результате недавно проведенного геномного анализа 44 пациентов с ПНБ была показана положительная корреляция между количеством CNVs и увеличением числа выкидышей (Karim et al., 2017).
Таким образом целью данного исследования являлось выявление CNVs, потенциально связанных с гибелью эмбрионов, у женщин с невынашиванием беременности и экстремальным смещением инактивации Х-хромосомы.
Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
1. Определение характера инактивации Х-хромосомы в выборке и установление связи между ним и эмбриолетальностью;
2. Выявление вариаций числа копий участков ДНК у женщин с невынашиванием беременности и экстремальным sXCI;
3. Анализ кандидатных генов, задействованных в микроперостройках, нарушение дозы которых может быть ассоциировано с невынашиванием беременности;
Работа выполнена на базе НИИ медицинской генетики Томского национального исследовательского медицинского центра РАН в лаборатории цитогенетики под руководством кандидата биологических наук Толмачевой Екатерины Николаевны. Автор 6
выражает благодарность научному руководителю за помощь при написании выпускной квалификационной работы бакалавра.
