Аннотация
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ 3
ВВЕДЕНИЕ 4
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 6
1.1 Проблема невынашивания беременности. Моносомия X хромосомы.
6
1.2 Метилирование ДНК 8
1.3 Распределение метилирования CpG-сайтов в геноме человека 12
1.4 Методы определения метилирования ДНК 14
1.5 Связь между метилированием ДНК и возникновением анеуплоидий 19
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 22
2.1 Материалы 22
2.2 Методы 22
2.2.1 Выделение ДНК из ворсин хориона 22
2.2.2 Флуоресцентная in situ гибридизация 23
2.2.3 Проведение реакции рестрикции 24
2.2.4 End-repairing и A-tailing 24
2.2.5 Лигирование 24
2.2.6 Выделение ДНК из агарозного геля 24
2.2.7 Бисульфитная конверсия ДНК 25
2.2.8 Получение библиотек 26
2.2.9 Чистка ПЦР продукта с помощью магнитных шариков 26
2.2.10 Секвенирование полученных библиотек и биоинформатическая обработка 26
2.2.11 Обработка данных инструментами bedtools и пакетами R 27
3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Ошибка! Закладка не определена.
4 ЗАКЛЮЧЕНИЕ
5 ВЫВОДЫ
6 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 29
Самопроизвольный аборт или выкидыш - гибель эмбриона или плода до двадцать второй недели беременности (после 22 недель употребляется термин мертворождение). Среди клинически подтвержденных беременностей частота самопроизвольных выкидышей составляет около 15%. Однако, по оценкам, от 50 до 75% всех беременностей заканчиваются выкидышами. Среди них, большинство абортированных эмбрионов прекращает развитие вскоре после имплантации в течении первых 7 недель, когда трофобласт эмбриона внедряется в эндометрий. Данный процесс аналогичен инвазии и метастазированию опухоли и проявляется в виде меноррагии или задержки менструации [1, 2]. Причины самопроизвольного выкидыша разнообразны, и в первую очередь связаны с анеуплоидией, встречающейся у 50% всех спонтанных абортусов первого триместра.
Причинами самопроизвольного аборта могут быть аномалии развития репродуктивной системы матери, эндокринные и иммунологические дисфункции, малоподвижные сперматозоиды, инфекции репродуктивного тракта, цервикальная недостаточность, тромбофилии и хромосомные аномалии [1, 3]. Среди них наиболее часто встречаются трисомии, за которыми следует аутосомные несбалансированные транслокации и полиплоидии, моносомия X, аутосомные моносомии, сбалансированные хромосомные транслокации, делеции, химеризм, инверсии и так далее [4, 5].
На моносомию хромосомы Х приходится около 17 % всех случаев самопроизвольного аборта, считается, что 99% эмбрионов с моносомией X самопроизвольно прерываются в течение первого триместра, 1% случаев составляет выжившее меньшинство (Hassold, 1986). Частичная или полная потеря хромосомы Х приводит к синдрому Шерешевского-Тернера.
Возникновение анеуплоидии связано с ошибками сегрегации хромосом в мейозе в половых клетках родителей и в первых митотических делениях оплодотворенной зиготы. Возникновение митотической анеуплоидии в первых делениях эмбриона совпадает с волной эпигенетического перепрограммирования на стадии дробления, представляющим собой процесс перехода от эпигенетических программ, характерных для половых клеток, к запуску эпигенетической программы развития многоклеточного организма. Кроме того, есть данные, свидетельствующие о том, что в основе некоторых случаев невынашивания беременности на ранних сроках могут лежать эпигенетические аномалии [7]. Это связано с ключевым значением эпигенетической регуляции экспрессии генов в различных типах клеток в развитии организма [8].
Одним из механизмов эпигенетической регуляции является метилирование ДНК. Метилирование ДНК - добавление метильной группы к углероду 5 цитозина, 4
присутствующего в динуклеотидах CpG [9]. Метилирование ДНК - это важный регуляторный процесс, влияющий на экспрессию генов и защищающий от проникновения в клетку чужеродной ДНК, а также распространения в геноме мобильных элементов. В последние годы в литературе появляется все больше сведений о значительном влиянии изменения профиля метилирования ДНК на возникновение анеуплоидии. Предполагается, что снижение уровня глобального метилирования генома оказывает влияние на частоту возникновения числовых хромосомных аберраций вследствие гипометилирования цитозина в центромерных и прицентромерных участках хромосом, которое, в свою очередь, приводит к изменению конформации прицентромерного хроматина, нарушениям прикрепления микротрубочек веретена деления к хромосомам и, в конечном итоге, к неправильной сегрегации хромосом и анеуплоидии [10,11]. Кроме того, известно, что анеуплоидия приводит к значительному изменению профиля метилирования по всему геному [92]. Для разных регионов генома характерно наличие собственного локального уровня метилирования.
Таким образом, целью данного исследования стало определение паттернов изменения уровня метилирования, выяснение закономерностей распределения CpG-сайтов с измененным уровнем метилирования по геному и, как следствие, оценка влияния геномного контекста на нарушения метилирования ДНК в ворсинках хориона при самопроизвольных абортах первого триместра беременности с моносомией по Х- хромосоме.
В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:
1. Выявить аномалии вариации уровня метилирования в хорионе спонтанных абортусов с моносомией X.
2. Проанализировать распределение дифференциально-метилированных CpG-сайтов по геному в хорионе спонтанных абортусов с моносомией X.
3. Определить регионы генома с повышенной концентрацией дифференциально- метилированных CpG-сайтов в хорионе спонтанных абортусов с моносомией X. Работа выполнена на базе лаборатории инструментальной геномики НИИ
медицинской генетики Томского НИМЦ.
