АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ, СВЯЗАННЫХ С РАЗЛИЧНОЙ ЭФФЕКТИВНОСТЬЮ РЕПАРАЦИИ ДНК В СОМАТИЧЕСКИХ КЛЕТКАХ ЧЕЛОВЕКА
|
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 3
ВВЕДЕНИЕ 4
1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 7
1.1 Основные системы, обеспечивающие ответ на воздействие радиации 7
1.1.1 Антиоксидантная защита 7
1.1.2 Репарация ДНК 8
1.1.3 Регуляция клеточного цикла 9
1.1.4 Клеточный иммунитет 10
1.2 Роль репарации двунитевых разрывов ДНК в поддержании стабильности генома ...11
1.2.1 Негомологичное соединение концов 12
1.2.2. Гомологичная рекомбинация 15
1.3 Сигнальные пути, задействованные в радиационно-индуцированном ответе, и
связанные с ними транскрипционные факторы 16
1.3.1 Тирозинкиназа Src 16
1.3.2 Белок теплового шока 90 18
1.3.3 Фактор транскрипции AP-1 19
1.3.4 Фактор транскрипции NF-KB 20
1.3.5 МАРК 22
1.3.6 TGF-P 23
1.4 Роль протеаз межклеточного матрикса в радиационно-индуцированном ответе 25
1.4.1 ADAMTS1 25
1.4.2 THBS1 26
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 29
2.1 Материалы 29
2.2 Схема эксперимента 29
2.3 Культивирование клеточных линий 31
2.4 Воздействие ионизирующим излучением 32
2.5 Оценка клональной выживаемости 32
2.6 Анализ частоты микроядер 32
2.7 Полнотранскриптомный анализ 33
2.7.1 Выделение РНК 33
2.7.2 Очистка РНК 34
2.7.3 Оценка качества РНК 34
2.7.4 Введение флуоресцентной метки в образец РНК 34
2.7.5 Очистка флуоресцентно-меченных образцов РНК 35
2.7.6 Гибридизация меченых образцов РНК на микрочипах 35
2.8 Количественная ПНР в режиме реального времени 36
2.8.1 Разработка и проверка эффективности олигонуклеотидных праймеров 36
2.8.1.1 Подбор праймеров 36
2.8.1.2 Обратная транскрипция 37
2.8.1.3 Проверка эффективности праймеров и отработка условий проведения ПЦР 38
2.8.1.4 Электрофорез в агарозном геле 39
2.8.2 Проведение ПЦР в режиме реального времени 40
2.9 Статистическая обработка данных 40
3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 42
3.1 Влияние нокаута генов ADAMTS1 и THBS1 на клональную выживаемость в
условиях in vitro 42
3.2 Влияние нокаута генов ADAMTS1 и THBS1 на частоту микроядер в условиях in vitro 44
3.3 Влияние нокаута генов ADAMTS1 и THBS1 на транскрипционную регуляцию в
клеточных линиях in vitro 45
ВЫВОДЫ 54
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 55
ВВЕДЕНИЕ 4
1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 7
1.1 Основные системы, обеспечивающие ответ на воздействие радиации 7
1.1.1 Антиоксидантная защита 7
1.1.2 Репарация ДНК 8
1.1.3 Регуляция клеточного цикла 9
1.1.4 Клеточный иммунитет 10
1.2 Роль репарации двунитевых разрывов ДНК в поддержании стабильности генома ...11
1.2.1 Негомологичное соединение концов 12
1.2.2. Гомологичная рекомбинация 15
1.3 Сигнальные пути, задействованные в радиационно-индуцированном ответе, и
связанные с ними транскрипционные факторы 16
1.3.1 Тирозинкиназа Src 16
1.3.2 Белок теплового шока 90 18
1.3.3 Фактор транскрипции AP-1 19
1.3.4 Фактор транскрипции NF-KB 20
1.3.5 МАРК 22
1.3.6 TGF-P 23
1.4 Роль протеаз межклеточного матрикса в радиационно-индуцированном ответе 25
1.4.1 ADAMTS1 25
1.4.2 THBS1 26
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 29
2.1 Материалы 29
2.2 Схема эксперимента 29
2.3 Культивирование клеточных линий 31
2.4 Воздействие ионизирующим излучением 32
2.5 Оценка клональной выживаемости 32
2.6 Анализ частоты микроядер 32
2.7 Полнотранскриптомный анализ 33
2.7.1 Выделение РНК 33
2.7.2 Очистка РНК 34
2.7.3 Оценка качества РНК 34
2.7.4 Введение флуоресцентной метки в образец РНК 34
2.7.5 Очистка флуоресцентно-меченных образцов РНК 35
2.7.6 Гибридизация меченых образцов РНК на микрочипах 35
2.8 Количественная ПНР в режиме реального времени 36
2.8.1 Разработка и проверка эффективности олигонуклеотидных праймеров 36
2.8.1.1 Подбор праймеров 36
2.8.1.2 Обратная транскрипция 37
2.8.1.3 Проверка эффективности праймеров и отработка условий проведения ПЦР 38
2.8.1.4 Электрофорез в агарозном геле 39
2.8.2 Проведение ПЦР в режиме реального времени 40
2.9 Статистическая обработка данных 40
3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 42
3.1 Влияние нокаута генов ADAMTS1 и THBS1 на клональную выживаемость в
условиях in vitro 42
3.2 Влияние нокаута генов ADAMTS1 и THBS1 на частоту микроядер в условиях in vitro 44
3.3 Влияние нокаута генов ADAMTS1 и THBS1 на транскрипционную регуляцию в
клеточных линиях in vitro 45
ВЫВОДЫ 54
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 55
Лучевая терапия наряду с химиотерапией и хирургическими методами является на сегодняшний день одним из основных подходов к лечению рака. В течение последних нескольких десятилетий были достигнуты значительные успехи в применении лучевой терапии, что привело к повышению выживаемости пациентов со злокачественными новообразованиями. Однако успешное применение данного метода осложняется по двум причинам: радиорезистентность клеток опухоли и повреждение клеток нормальной ткани, находящихся в области воздействия ионизирующего излучения. Эти ограничения требуют разработки способов либо радиосенсибилизации опухолевых клеток, либо защиты клеток нормальной ткани от воздействия ионизирующего излучения (ИИ) [Maier et al., 2016]. Поскольку радиочувствительность - во многом генетически детерминированное качество клетки, ткани и организма в целом, поиск путей решения обозначенной выше проблемы необходимо начать с анализа вклада различных генов в формирование индивидуальной радиочувствительности. Таким образом, выявление и всестороннее изучение генов, определяющих индивидуальную радиочувствительность человека, является одной из приоритетных задач в современной лучевой терапии онкологических заболеваний.
Нормальное протекание важнейших биологических процессов, обуславливающих жизнедеятельность клетки, возможно лишь при определённом уровне экспрессии генов, детерминирующих основные события клеточного цикла. К таковым можно отнести процессы матричного синтеза, в том числе репарацию ДНК - главный механизм устранения повреждений, возникающих в результате действия различных внешних факторов. Одним из таких факторов является ионизирующее излучение, приводящее к нарушению нативной структуры ДНК и образованию в молекуле двунитевых разрывов. Таким образом, репарация ДНК — процесс, лежащий в основе восприимчивости клеток и, как следствие, целого организма, к воздействию ионизирующего излучения [Borras- Fresneda et al., 2016].
События, направленные на восстановление целостности двойной спирали ДНК, влекут за собой изменения в транскрипционном профиле. Таким образом, на основе сопоставления уровней экспрессии генов, продукты которых могут быть задействованы в процессе репарации, до и после воздействия ионизирующего излучения можно сделать вывод как о функциональных особенностях отдельных групп генов, так и о возможных взаимодействиях между ними. Проведение анализа транскрипционных профилей в клеточных линиях, нокаутных по определенным генам, позволяет выявить пути регуляции экспрессии генов с участием нокаутированного гена в отсутствии априорной информации о возможных путях такой регуляции.
Ранее в лаборатории цитогенетики НИИ медицинской генетики Томского НИМЦ (г. Томск) проводились исследования, выявившие гены, дифференциальная экспрессия которых оказалась связана с эффективностью репарации двунитевых разрывов ДНК [Васильев и др., 2015]. Полнотранскриптомный анализ профилей экспрессии в лимфоцитах периферической крови индивидов с различной эффективностью репарации двунитевых разрывов ДНК выявил более 500 дифференциально-экспрессирующихся генов. В том числе, между группами индивидов с различной эффективностью репарации ДНК значимо отличалась экспрессия генов ADAMTS1 и THBS1. Связь дифференциальной экспрессии данных генов с эффективностью репарации двунитевых разрывов ДНК была подтверждена в двух различных типах клеток: лимфоцитах периферической крови и фибробластах экстраэмбриональной мезодермы. Продукты генов ADAMTS1 и THBS1 являются металлопротеиназами межклеточного матрикса и принимают участие в передаче в клетку различных сигналов [Bourd-Boittin et al., 2011; Resovi et al., 2014]. Проверка влияния данных генов на радиочувствительность клеток требует проведения исследований в модельных системах in vitro. Кроме того, учитывая, что в предварительных исследованиях индивиды отличались по экспрессии множества генов, потенциально продукты исследуемых генов могут участвовать в путях транскрипционной регуляции. Установление путей такой регуляции возможно с помощью полнотранскриптомного анализа экспрессии в клеточных линиях с нокаутом данных генов.
Таким образом, целью настоящего исследования являлся анализ влияния нокаута генов ADAMTS1 и THBS1 на радиочувствительность и радиационно-индуцированный транскрипционный ответ в опухолевой клеточной линии HeLa.
Для достижения цели были выполнены следующие задачи:
1. Выполнить анализ клональной выживаемости клеточных линий, нокаутных по генам ADAMTS1 и THBS1, по сравнению с исходной клеточной линией HeLa.
2. Оценить частоту микроядер в клеточных линиях, нокаутных по генам ADAMTS1 и THBS1, по сравнению с исходной клеточной линией HeLa.
3. Осуществить полнотранскриптомный анализ экспрессии генов в опухолевой клеточной линии HeLa с нокаутом генов ADAMTS1 и THBS1 в необлученных клетках и после воздействия ионизирующего излучения.
4. Валидировать результаты полнотранскриптомного анализа с помощью ПЦР в режиме реального времени.
5. Провести статистическую обработку полученных данных.
Работа выполнена на базе лаборатории цитогенетики НИИ медицинской генетики Томского НИМЦ под руководством доктора биологических наук Васильева Станислава Анатольевича.
Нормальное протекание важнейших биологических процессов, обуславливающих жизнедеятельность клетки, возможно лишь при определённом уровне экспрессии генов, детерминирующих основные события клеточного цикла. К таковым можно отнести процессы матричного синтеза, в том числе репарацию ДНК - главный механизм устранения повреждений, возникающих в результате действия различных внешних факторов. Одним из таких факторов является ионизирующее излучение, приводящее к нарушению нативной структуры ДНК и образованию в молекуле двунитевых разрывов. Таким образом, репарация ДНК — процесс, лежащий в основе восприимчивости клеток и, как следствие, целого организма, к воздействию ионизирующего излучения [Borras- Fresneda et al., 2016].
События, направленные на восстановление целостности двойной спирали ДНК, влекут за собой изменения в транскрипционном профиле. Таким образом, на основе сопоставления уровней экспрессии генов, продукты которых могут быть задействованы в процессе репарации, до и после воздействия ионизирующего излучения можно сделать вывод как о функциональных особенностях отдельных групп генов, так и о возможных взаимодействиях между ними. Проведение анализа транскрипционных профилей в клеточных линиях, нокаутных по определенным генам, позволяет выявить пути регуляции экспрессии генов с участием нокаутированного гена в отсутствии априорной информации о возможных путях такой регуляции.
Ранее в лаборатории цитогенетики НИИ медицинской генетики Томского НИМЦ (г. Томск) проводились исследования, выявившие гены, дифференциальная экспрессия которых оказалась связана с эффективностью репарации двунитевых разрывов ДНК [Васильев и др., 2015]. Полнотранскриптомный анализ профилей экспрессии в лимфоцитах периферической крови индивидов с различной эффективностью репарации двунитевых разрывов ДНК выявил более 500 дифференциально-экспрессирующихся генов. В том числе, между группами индивидов с различной эффективностью репарации ДНК значимо отличалась экспрессия генов ADAMTS1 и THBS1. Связь дифференциальной экспрессии данных генов с эффективностью репарации двунитевых разрывов ДНК была подтверждена в двух различных типах клеток: лимфоцитах периферической крови и фибробластах экстраэмбриональной мезодермы. Продукты генов ADAMTS1 и THBS1 являются металлопротеиназами межклеточного матрикса и принимают участие в передаче в клетку различных сигналов [Bourd-Boittin et al., 2011; Resovi et al., 2014]. Проверка влияния данных генов на радиочувствительность клеток требует проведения исследований в модельных системах in vitro. Кроме того, учитывая, что в предварительных исследованиях индивиды отличались по экспрессии множества генов, потенциально продукты исследуемых генов могут участвовать в путях транскрипционной регуляции. Установление путей такой регуляции возможно с помощью полнотранскриптомного анализа экспрессии в клеточных линиях с нокаутом данных генов.
Таким образом, целью настоящего исследования являлся анализ влияния нокаута генов ADAMTS1 и THBS1 на радиочувствительность и радиационно-индуцированный транскрипционный ответ в опухолевой клеточной линии HeLa.
Для достижения цели были выполнены следующие задачи:
1. Выполнить анализ клональной выживаемости клеточных линий, нокаутных по генам ADAMTS1 и THBS1, по сравнению с исходной клеточной линией HeLa.
2. Оценить частоту микроядер в клеточных линиях, нокаутных по генам ADAMTS1 и THBS1, по сравнению с исходной клеточной линией HeLa.
3. Осуществить полнотранскриптомный анализ экспрессии генов в опухолевой клеточной линии HeLa с нокаутом генов ADAMTS1 и THBS1 в необлученных клетках и после воздействия ионизирующего излучения.
4. Валидировать результаты полнотранскриптомного анализа с помощью ПЦР в режиме реального времени.
5. Провести статистическую обработку полученных данных.
Работа выполнена на базе лаборатории цитогенетики НИИ медицинской генетики Томского НИМЦ под руководством доктора биологических наук Васильева Станислава Анатольевича.
1. Клональная выживаемость значимо отличалась в клеточной линии с нокаутом ADAMTS1 (в 1,9 раза, p = 0,014) после воздействия в дозе 2 Гр.
2. В обеих нокаутных линиях частота микроядер значимо повышалась до и после облучения: в линии, нокаутной по гену ADAMTS1, частота микроядер повышалась относительно исходной линии HeLa в 1,6 раза (р = 0,001) до облучения и в 1,9 раза (р = 0,061) — после. В линии, нокаутной по гену THBS1, частота микроядер повышалась относительно исходной линии HeLa в 1,5 раза (р = 0,016) до облучения и в 2,1 раза (р = 0,008) — после.
3. В линии, нокаутной по гену ADAMTS1, экспрессия 57 генов изменялась по сравнению с исходной линией HeLa, в линии, нокаутной по гену THBS1, экспрессия 64 генов изменялась по сравнению с исходной линией HeLa; после облучения в линии с нокаутом ADAMTS1 экспрессия 103 генов изменялась по сравнению с облученной исходной линией HeLa, в линии с нокаутом THBS1 экспрессия 94 генов изменялась по сравнению с облученной исходной линией HeLa.
4. Результаты полнотранскриптомного анализа были валидированы с помощью ПЦР в режиме реального времени путём оценки уровня экспрессии гена — SEPP1.
5. Гены, дифференциально экспрессирующиеся при нокауте THBS1, оказались связаны с генами репарации ДНК. Гены, дифференциально экспрессирующиеся при нокауте ADAMTS1, оказались связаны с генами, регулирующими апоптоз.
2. В обеих нокаутных линиях частота микроядер значимо повышалась до и после облучения: в линии, нокаутной по гену ADAMTS1, частота микроядер повышалась относительно исходной линии HeLa в 1,6 раза (р = 0,001) до облучения и в 1,9 раза (р = 0,061) — после. В линии, нокаутной по гену THBS1, частота микроядер повышалась относительно исходной линии HeLa в 1,5 раза (р = 0,016) до облучения и в 2,1 раза (р = 0,008) — после.
3. В линии, нокаутной по гену ADAMTS1, экспрессия 57 генов изменялась по сравнению с исходной линией HeLa, в линии, нокаутной по гену THBS1, экспрессия 64 генов изменялась по сравнению с исходной линией HeLa; после облучения в линии с нокаутом ADAMTS1 экспрессия 103 генов изменялась по сравнению с облученной исходной линией HeLa, в линии с нокаутом THBS1 экспрессия 94 генов изменялась по сравнению с облученной исходной линией HeLa.
4. Результаты полнотранскриптомного анализа были валидированы с помощью ПЦР в режиме реального времени путём оценки уровня экспрессии гена — SEPP1.
5. Гены, дифференциально экспрессирующиеся при нокауте THBS1, оказались связаны с генами репарации ДНК. Гены, дифференциально экспрессирующиеся при нокауте ADAMTS1, оказались связаны с генами, регулирующими апоптоз.
