Аннотация
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 6
ВВЕДЕНИЕ 7
1 КЛЕТОЧНАЯ КУЛЬТУРА РАСТЕНИЙ И ЕЕ ЗНАЧЕНИЕ В БИОТЕХНОЛОГИИ 10
1.1 Культуры клеток растений как биологические модели 10
1.1.1 Введение в культуру клеток растений 11
1.1.2 Различные типы питательных сред и компонентов 13
1.1.3 Преимущества клеточных культур как моделей исследования растений 18
1.2 Характеристика рода Lychnis 19
1.2.1 Биохимический состав рода Lychnis и семейства Caryophyllaceae 20
2 БИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ САЛИЦИЛОВОЙ КИСЛОТЫ В РАСТИТЕЛЬНЫХ
СИСТЕМАХ 22
2.1 Биосинтез салициловой кислоты в растениях 22
2.2 Роль салициловой кислоты в регуляции роста и стресс-ответа растений 23
2.3 Сигнальная роль салициловой кислоты 24
2.4 Участие СК в ответах растений на действие абиотических факторов 26
3 ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 29
3.1 Объект исследования 29
3.2 Методы исследований 32
3.2.1 Приготовление питательной среды 32
3.2.2 Приготовление стерильной посуды 33
3.2.3 Работа в ламинарном боксе и культивирование 33
3.2.4 Построение кривой роста каллусной культуры 34
3.2.5 Культивирование каллусной культуры 35
3.2.6 Определение интенсивности перекисного окисления липидов 35
3.2.7 Определение содержания свободного пролина в клеточной культуре 36
3.2.8 Определение содержания растворимых фенольных соединений 37
3.2.9 Определение содержания пероксида водорода 38
3.2.10 Обработка и статистический анализ результатов 39
4 СПЕЦИФИКА РОСТА И МЕТАБОЛИЗМА КЛЕТОЧНОЙ КУЛЬТУРЫ LYCHNIS
CHALCEDONICA В ПРИСУТСТВИИ САЛИЦИЛОВОЙ КИСЛОТЫ 41
4.1 Маркеры окислительного стресса и состояние антиоксидантной системы в каллусных
культурах 41
4.2 Физиолого-биохимическая характеристика контрольных каллусных культур L.
chalcedonica листового и гипокотильного происхождения 43
4.3 Влияние салициловой кислоты на ростовые показатели культуры L. chalcedonica 52
4.4 Влияние салициловой кислоты на биохимические показатели культуры Lychnis
chalcedonica 55
ВЫВОДЫ 62
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 63
Сохранение биоразнообразия представителей растительного царства и получение генетического материала для селекции связано с распространенным в настоящее время биотехнологическим подходом к выращиванию растений in vitro.
Культивирование растительных клеток в условиях in vitro представляет собой перспективный инструмент современной биотехнологии, позволяющий целенаправленно отбирать клеточный материал, способный синтезировать специфические биологически активные соединения. Такие культуры выращиваются в строго регулируемых селективных средах, что обеспечивает высокий уровень контроля над их морфогенезом и метаболической активностью.
На сегодняшний день известно свыше 20 000 соединений природного происхождения, получаемых исключительно из растений. Однако из-за антропогенного воздействия и высокой скорости исчезновения дикорастущих видов воспроизводство этих источников биоактивных веществ становится всё более затруднительным. В связи с этим особую актуальность приобретает разработка и внедрение технологий получения вторичных метаболитов с заданными свойствами посредством культивирования растительных клеток in vitro. Такой подход позволяет сохранять редкие виды флоры и одновременно получать ценные соединения в стабильных условиях лабораторного производства.
Представитель семейства Caryophyllaceae - Lychnis chalcedonica L., известный как декоративное растение, включён в список редких видов Томской области и является малоизученным в аспекте биотехнологии. До настоящего времени для данного вида не создано устойчивой клеточной культуры. Интерес к нему обусловлен обнаружением высоких концентраций фитоэкдистероидов - природных веществ, промышленный синтез которых остаётся экономически невыгодным, что делает приоритетными методы биотехнологического производства и выделения из природных источников.
Фитоэкдистероиды представляют собой полифункциональные
фитостероиды, обладающие выраженными физиологическими эффектами: они способствуют повышению секреции тестостерона, усиливают транспорт аминокислот и гликогена в мышечные волокна, что, в свою очередь, стимулирует рост мышечной массы, повышает физическую выносливость, нормализует функционирование сердечно-сосудистой системы и ускоряет процессы восстановления после интенсивных нагрузок [Свиридова, 1989].
Учитывая дефицит информации о физиологических особенностях клеточных культур, полученных из различных органов L. chalcedonica, а также необходимость в изучении их метаболической продуктивности, целью настоящего исследования явилось получение каллусных культур данного вида из листовых и гипокотильных эксплантов, их сравнительная оценка по параметрам ростовой активности, а также исследование спектра продуцируемых ими вторичных метаболитов.
В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи:
1. Получить стабильные линии каллусных культур Lychnis chalcedonica in vitro от эксплантов листьев и гипокотиля, изучив их ростовой и метаболический потенциал в классической контрольной питательной среде.
2. Исследовать влияние салициловой кислоты на ростовые процессы каллусных линий Lychnis chalcedonica, полученных от эксплантов литьев и гипокотиля.
3. Оценить роль салициловой кислоты в регуляции метаболических процессов для каллусных культур, полученных от эксплантов листьев и гипокотиля. Обосновать возможность модификации питательной среды за счет салициловой кислоты.
Работа выполнена на кафедре физиологии растений, биотехнологии и биоинформатики Национального исследовательского Томского
государственного университета.
Автор работы выражает благодарность зав. кафедрой О. В. Карначук за предоставленную возможность специализироваться по данной тематике, научному руководителю профессору, доктору биологических наук И. Ф. Головацкой за помощь в выполнении работы, биотехнологу Ю. В. Медведевой за полезные рекомендации и аспиранту М. К. Кадырбаеву за помощь в освоении методик исследования.
Результаты материалов исследований представлены на 2-х Международных научных конференций (г. Минск, 2024; г. Саратов, 2024) и 2-х региональных студенческих конференций «Старт в науку» (Томск, 2024, 2025).
1) Получены стабильные каллусные линии Lychnis chalcedonica из эксплантов листа и гипокотиля. Установлено, что они обладают различными стратегиями роста: за счет разной последовательности оводненности и накопления сухого вещества, обе культуры подвержены окислительному стрессу на последнем этапе культивирования, что делает их удобной моделью для изучения действия протекторов.
2) Установлено, что салициловая кислота (10 9 М) стимулирует прирост сырой массы листовой линии, но не оказывает действия на этот показатель у гипокотильной линии. Однако под действием СК отмечено накопление сухого вещества обеих линий каллусной культуры.
3) Доказано, что салициловая кислота повышает устойчивость и продуктивность каллусных культур L. chalcedonica, но реализует это через разные, тканеспецифичные защитные стратегии. Листовая культура отвечает на действие СК смешанной стратегией, одновременно увеличивая содержание пролина и фенольных соединений (рост до 33% для каждого). В отличие от этого, гипокотильная культура использует специализированную стратегию, переключаясь преимущественно на мощный синтез фенолов (рост на 30-47%). Этот механизм оказался настолько эффективным в снижении стресса, что необходимость в высоком уровне стрессового пролина отпала, и его содержание, наоборот, уменьшилось на 16-21% по сравнению с контролем. Несмотря на различия в механизмах, обе стратегии эффективно снижали уровень повреждения мембран (ПОЛ), что обосновывает целесообразность использования салициловой кислоты для повышения адаптивного потенциала и продуктивности (особенно по фенольным соединениям) каллусных культур L. chalcedonica.
