СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 4
Введение 5
Цель и задачи 6
Актуальность 7
ГЛАВА 1. ХАРАКТЕРИСТИКА LENTINULA EDODES И ЕГО СВОЙСТВА 9
1.1. Филогенетическое положение Lentinula edodes 10
1.2. Морфофизиологическое описание вида Lentinula edodes 11
1.3. Lentinula edodes как источник биологически активных веществ 14
ГЛАВА 2. ХАРАКТЕРИСТИКА ФЕНОЛОКИСЛЯЮЩИХ ФЕРМЕНТОВ И
ОСОБЕННОСТЕЙ ПИТАНИЯ БАЗИДИАЛЬНЫХ ГРИБОВ 16
2.1. Комплекс лигнолитических ферментов 16
2.1.1. Лакказы 17
2.1.2. Пероксидазы 18
2.2. Особенности углеродного и азотного питания грибов 21
2.2.1. Особенности использования углерода грибами 21
2.2.2. Особенности использования азота грибами 22
2.3. Деградация фенольных соединений и ксенобиотиков L.edodes 24
ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 26
3.1. Объект исследования 26
3.2. Питательные среды для культивирования мицелия L. edodes 27
3.3. Методика культивирования мицелия L. edodes 28
3.4. Определение ферментативной активности 34
3.5. Определение накопления белка 36
3.6. Определение биомассы 36
3.7. Определение общей суммы фенольных соединений в среде 36
3.8. Определение концентрации кислорода в среде 36
3.9. Определение рН и Ей среды 37
3.10. Обработка данных 37
ГЛАВА 4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ 38
4.1. Влияние состава питательных сред на физиологические показатели L. edodes 38
4.1.1. Влияние состава твердых питательных сред на рост мицелия L. edodes 38
4.1.2. Влияние состава жидких питательных сред на активность
лигнолитических ферментов L. edodes 41
4.1.3. Влияние различных источников углерода на активность
лигнолитического комплекса ферментов L. edodes 42
4.1.4. Влияние различных источников азота на активность лигнолитического
комплекса ферментов L. edodes 43
4.2. Сравнение различных показателей жизнедеятельности L. edodes при различных
концентрациях кислорода в питательной среде 46
4.3. Влияние фенольных соединений на морфофизиологические показатели
Lentinula edodes 52
4.3.1. Влияние фенилфенола на морфофизиологические показатели
Lentinula edodes 53
4.3.2. Влияние фенола на морфофизиологические показатели Lentinula
edodes 58
ВЫВОДЫ 61
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ИСТОЧНИКОВ ЛИТЕРАТУРЫ 62
На сегодняшний день актуальной становится проблема поиска новых химических веществ для разных отраслей промышленности. При этом, все чаще человечество обращается к природным биологическим соединениям, прежде всего, из-за их экологической безопасности. В таких соединениях нуждаются многие отрасли: пищевая, целлюлозно-бумажная и косметическая промышленности, фармакология и т.д. Также следует отметить, что в современном индустриальном обществе особо стоит проблема загрязнения окружающей среды. Поэтому важен поиск природных соединений, которые способны разрушать компоненты, загрязняющие планету.
Одним из источников таких природных соединений являются ксилотрофные грибы. Экологическая группа ксилотрофных макромицетов способна полностью разрушать компоненты древесины, тем самым выступая в качестве главных редуцентов в лесных экосистемах. Одним из таких грибов является шиитаке (Lentinula edodes) - ксилотрофный гриб известный своими вкусовыми качествами, а также лечебными свойствами.
Работа проводилась в лаборатории биотехнологии и биоинженерии кафедры физиологии растений и биотехнологии Томского государственного университета (ТГУ).
Автор выражает искреннюю благодарность научным руководителям: профессору, доктору биологических наук Ольге Викторовне Карначук и аспиранту Евгению Владимировичу Плотникову за внимание, научное руководство и консультации в постановке экспериментов. А также глубокую признательность всему коллективу кафедры физиологии растений и биотехнологии ТГУ за постоянную поддержку и внимание.
Цель: Оптимизировать продуктивность биотехнологически значимых ферментов при культивировании мицелия Lentinula edodes
В соответствии с целями были поставлены следующие задачи:
• Изучить влияние состава твердых и жидких питательных сред на физиологические показатели развития мицелия
• Исследовать изменение активности лигнолитических ферментов при аэрофильном и микроаэрофильном режимах культивирования
• Установить влияние различных фенольных соединений, в том числе ксенобиотиков, на рост, накопление биомассы и активность лигнолитических ферментов L. edodes
1. Состав питательных сред влияет на физиологические показатели развития мицелия. Среда S.Tsujiyama является наиболее подходящей для культивирования L. edodes. Активность лигнолитических ферментов не зависит от источника углерода, но зависит от источника азота. Глутамат является активатором лакказ.
2. При макроаэрофильном способе культивирования накопление белка L. edodes в 3 раза эффективнее, чем при микроаэрофильном; лакказная активность строго зависит от содержания кислорода в среде.
3. Фенилфенол имел выраженный токсический эффект по сравнению с фенолом. Ингибирующее воздействие на рост мицелия L. edodes наблюдали при концентрации фенилфенола 0,1 мМ, в то время как для фенола подавление роста наблюдали при концентрации 10 мМ. Ванилин и фенилфенол повышали лигнолитическую активность изученных ферментов. При этом фенилфенол в концентрации 0,01 - 0,1 мМ увеличивал продукцию Lcc, но уровень MnP падал по сравнению с контролем. Добавление ванилина усиливал токсический эффект фенилфенола. Максимальный выход биомассы наблюдался при культивировании с 0.01 mM фенилфенолом.
Фенол повышал лигнолитическую активность изученных ферментов, при концентрации 0,1 мМ продукция MnP возрастала приблизительно в два раза.
