Аннотация
ОГЛАВЛЕНИЕ 2
ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, СИМВОЛОВ, СОКРАЩЕНИЙ, ТЕРМИНОВ 4
ВВЕДЕНИЕ 5
1 Обзор литературы 7
1.1 Системы репарации ДНК Escherichia coli 7
1.2 Включение дУТФ в ДНК и элиминация этого процесса
дезоксиуридинтрифосфатазой 9
1.2.1 Причины и последствия включение дУТФ в молекулу ДНК 9
1.2.2 Роль дезоксиуридинтрифосфатазы (DUT) в устранении предмутагенного
дУТФ 12
1.3 Дезоксиуридинтрифосфатаза (DUT) и биосинтез пиримидиновых
дезоксинуклеотидов в клетке 13
1.3.1 Общая схема процесса биосинтеза пиримидиновых дезоксинуклеотидов в
клетке 13
1.3.2 Вклад дезоксиуридинтрифосфатазы в процесс биосинтеза пиримидиновых
дезоксинуклеотидов 14
1.4 Структурные и ферментативные характеристики дезоксиуридинтрифосфатазы 16
2 Материалы и методы 25
2.1 Создание генетической конструкции в ПО SnapGene 25
2.2 Рестрикция 25
2.3 Проведение агарозного гель-электрофореза и очистка ДНК фрагментов из геля 26
2.4 Лигирование 26
2.5 Трансформация компетентных клеток и посев на твёрдую среду 26
2.6 Выделение плазмидной ДНК 27
2.7 Анализ наличия искомой вставки у полученных штаммов с помощью ПЦР 27
2.8 Индукция синтеза белка DUT в клетках штамма BL21 Star 28
2.9 Полиакриламидный гель-электрофорез (ПААГ электрофорез) для анализа белков .... 28
2.10 Ультразвуковая экстракция белков из бактериальных клеток и осаждение
клеточного дебриса 29
2.11 Очистка белка DUT методом афинной хроматографии 29
2.12 Очистка белка DUT методом анионообменной хроматографии 29
2.13 Диализ белка DUT 29
2.14 Анализ способности белка собираться в гомотример на приборе Tycho
(NanoTemper, Германия) 29
2.15 Анализ ферментативной активности 30
2.16 Ферментативная кинетика Михаэлиса - Ментен 30
2.17 ВЭЖХ для анализа продуктов ферментативной реакции 30
3 Результаты и обсуждения 31
3.1 Разработка вектора для экспрессии гена dut в ПО SnapGene 31
3.2 Создание генетической конструкции pET-23c + DUT, проверка корректности сборки
и создание экспрессионного штамма 34
3.2.1 Получение плазмиды, несущей ген dut 34
3.2.2 Получение штамма поддержки DH5a, несущего плазмиду со встройкой гена
dut 35
3.2.3 Рестрикционный анализ для проверки успешной встройки фрагмента DUT в
плазмиду 35
3.2.4 Секвенирование гена dut по методу Сэнгера 37
3.2.5 Создание штамма экспрессии BL21 Star, несущего плазмиду рЕТ-23с + DUT 37
3.2.6 Анализ наличия искомой вставки у единичных колоний с помощью ПЦР с
использованием Т7-праймеров 38
3.3 Индукция синтеза белка DUT в клетках штамма экспрессии BL21 Star, несущего
плазмиду pET-23c + DUT 40
3.3.1 Индукция синтеза белка DUT в клетках штамма экспрессии BL21 Star 40
3.3.2 Проверка эффективности экспрессии белка DUT методом полиакриламидного
гель-электрофореза 40
3.4 Очистка белка DUT с помощью хроматографического подхода 42
3.4.1 Афинная хроматография белка DUT с использованием Ni-NTA агарозы 42
3.4.2 Анионообменная хроматография белка DUT с использованием Q-сефарозы 44
3.5 Оценка активности DUT и изучение ферментативных характеристик 47
3.5.1 Анализ способности белка DUT собираться в гомотример 47
3.5.2 Проверка активности фермента с применением тонкослойной хроматографии .... 48
3.5.3 Изучение кинетики Михаэлиса-Ментен фермента DUT с применением ВЭЖХ
(высокоэффективной жидкостной хроматографии) 49
3.6 Заключение 52
ВЫВОДЫ 53
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ И ЛИТЕРАТУРЫ 54
Актуальность научно-исследовательской работы:
Дезоксиуридинтрифосфатаза (DUT) - белок системы репарации ДНК,
гидролизующий предмутагенный дезоксинуклеозидтрифосфат дУТФ. Предотвращение включения дУТФ в ДНК имеет важное значение для сохранения генетической информации, так как впоследствии может привести к ошибкам при репликации и транскрипции и синтезу дефектного белка. Поэтому для полной жизнеспособности в большинстве биологических систем требуется быстрое и специфическое удаление дУТФ из пула нуклеотидов, ускоряемое повсеместным ферментом DUT. Наиболее распространенным семейством DUT является гомотримерная разновидность. Структурно-функциональные и ферментативные исследования необходимы для полного понимания свойств DUT в связи с их биологической ролью и возможности использования, как для исправления повреждений, так и наоборот, увеличения ошибок в ДНК в качестве мишени антибиотиков нового поколения.
Фермент DUT представляет интерес и с точки зрения синтетической биологии и биоаналитических приложений как потенциальный компонент наборов для ПЦР. Его внесение в состав смеси дНТФ позволит дополнительно уменьшить количество в смеси дУТФ, тем самым обеспечив более точную репликацию цепей ДНК за счет исключения возможности встраивания этого нуклеотида. Такая точность может быть необходима при подготовке образца к секвенированию или при проведении молекулярного клонирования.
Таким образом, предполагается выделение и характеристика активности белка DUT. Это позволит обеспечить лучшее понимание предмутационных процессов и создать продукт для практических приложений в исследовательской деятельности.
Цель научно-исследовательской работы: Создание конструкции штамма E. coli для суперпродукции белка DUT, его выделение и характеристика активности.
Задачи научно-исследовательской работы:
1. Создание плазмиды экспрессии, несущей ген дезоксиуридинтрифосфатазы (dut).
2. Создание штамма экспрессии E. coli, несущего плазмиду для суперпродукции белка дезоксиуридинтрифосфатазы (DUT).
3. Наработка белка дезоксиуридинтрифосфатазы (DUT). Выделение и очистка белка DUT.
4. Оценка активности выделенного белка дезоксиуридинтрифосфатазы (DUT) из Escherichia coli .
Выполнение научно-исследовательской работы проходило на базе лаборатории экологии, генетики и охраны окружающей среды НИИ Биологии и биофизики ТГУ и на базе лаборатории геномной и белковой инженерии ИБХФМ СО РАН (г. Новосибирск) под руководством канд. биол. наук, доцента каф. генетики и клеточной биологии Алины Андреевны Коханенко.
1. Создана плазмида pET-23c + DUT со встройкой гена дезоксиуридинтрифосфатазы (dut).
2. Получен штамм экспрессии BL21 Star, несущий плазмиду pET-23c + DUT, обеспечивающий гиперпродукцию белка дезоксиуридинтрифосфатазы (DUT).
3. С помощью метода тонкослойной хроматографии показано, что дезоксиуридинтрифосфатаза (DUT) обладает активностью к субстрату дУТФ и способна катализировать гидролиз дУТФ до дУМФ. Анализ результатов кинетики Михаэлиса-Ментен DUT с применением высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) выявил, что значение kcat соответствует 7,1922 ± 0,2093 с-1, а KM = 0,6338 ± 0, 0756 мкМ.
