Тема: ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ТРАНСДУКЦИИ НЕЙРОНОВ В ПЕРВИЧНОЙ КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК ГОЛОВНОГО МОЗГА МЫШИ ВИРУСНЫМИ ВЕКТОРАМИ AAV2/9 С ТРАНСГЕНАМИ ПОД ПРОМОТОРОМ DCX

Нейрогенез у взрослых млекопитающих можно определить процесс генерации и развития новых нейронов из нейрональных предшественников в нейрогенных нишах. Наличие данного процесса с мозге взрослых млекопитающих является доказанным фактом с тех пор как несколько групп ученых продемонстрировали, что определенные зоны мозга различных видов обладают нейрогенным потенциалом. Взрослый нейрогенез может стать ключом к лечению широкого спектра нейродегенеративных и нервнопсихических заболеваний при более глубоком понимании механизмов, обеспечивающих регенерацию новых нейронов [Just et al., 2022].
Нейрогенез также может проявляться, как компенсаторный механизм при патологических состояниях, представляя собой сложный процесс, включающий миграцию нейрональных предшественников в очаги поражения и формирование новых нейрогенных ниш [Cardoso et al., 2021]. Для изучения данных процессов было бы удобно использовать высокоинформативные методы мечения клеток нейрогенных ниш и их прижизненной визуализации, сегодня же многие заключения и предположения и процессах нейрогенеза строятся на основе анализа ex vivo препаратов головного мозга [Khodanovich et al., 2020].
Магнитно-резонансная томография (МРТ) - это информативный метод, основанный на резонансных свойствах атомных ядер и который позволяет неинвазивно визуализировать анатомические структуры и физиологические процессы. Комбинация данного метода с трансдукцией - процессом переноса генетического материала в клетки с помощью вирусов - клеток мишеней и доставкой в них репортерных генов, которые могут прямо или косвенно продуцировать контрастные сигналы на МРТ является перспективным направлением для прижизненного изучения нейрогенных ниш млекопитающих [Gao et al., 2022].
Для проведения подобных исследований необходимо подобрать векторную конструкцию, которая будет эффективно трансдуцировать целевые клетки, не будет вызывать цитотоксичности и иммунного ответа, а также эффективно экспрессировать встроенный трансген длительное время. Во многом данным условиям удовлетворяют векторы на основе аденоассоциированного вируса [Li and Samulski, 2020].
Тестирование векторных конструкций для определения их эффективности наиболее наглядно и точно может быть проведено с использованием in vitro моделей, поэтому цель данной работы - оценить эффективность трансдукции DCX+ нейронов мыши (P1-2) векторами на основе аденоассоциированного вируса, несущими трансгены под промотором DCX человека in vitro.
В соответствие с целью были поставлены задачи:
1. Получение, культивирования и иммунофенотипирование первичной культуры нейронов головного мозга мыши.
2. Оценка эффективности трансдукции клеток векторами AAV2/9-pDCX-eGFP и AAV2/9-pDCX-FerrH на трех временных точках.
3. Анализ динамики процесса трансдукции и созревания трансдуцированных нейронов в течение одной недели .
В данной работе для анализа динамики процесса трансдукции были использованы генетические векторы на основе AAV. В качестве специфического промотора векторы содержали человеческий промотор даблкортина (DCX), в качестве трансгенов использовались последовательности зеленого флуоресцентного белка (eGFP) тяжелой цепи ферритина (FerrH), который может быть визуализирован на МРТ благодаря высокому содержанию железа.

Купить

В настоящей работе проведено исследование динамики процесса трансдукции культивируемых DCX+ нейронов постнатальной мыши двумя тканеспецифичными векторами на основе аденоассоциированного вируса: AAV2/9-pDCX-eGFP и AAV2/9- pDCX-FerrH. Полученные результаты показали различную степень эффективности трансдукции двух векторов на разных временных точках, при этом исследуемый фактор MOI (отношение количества вирусных частиц к количеству клеток в культуре) по результатам статистического анализа был охарактеризован, как не влияющий на эффективность трансдукции на рассматриваемых сроках (1-7 дней). В то же время результаты анализа цитотоксичности векторов на позднем сроке трансдукции показали отрицательный эффект высоких доз векторов на выживаемость нейронов в культуре. Неоднозначность результатов на 7 день после трансдукции для AAV-pDCX-eGFP может быть связана с гибелью клеток, опосредованной неблагоприятными культуральными условиями, а также чрезмерной трансдукцией, которая выражалась в “метаболической нагрузке” на нейроны (синтез трансгенного белка).
Во время выполнения исследовательской работы было проведено тестирование протокола первичной культуры постнатальных нейронов с параллельной оценкой его особенностей и недостатков, на основании чего были предложены предприняты попытки его модификации, что может оказаться полезным для проведения дальнейших работ, завязанных на in vitro моделях.
На используемой в нашем исследовании in vitro модели не удалось провести анализ более поздних стадий трансдукции нейронов, а также оценить эффективность накопления железа нейронами, трансдуцированными вектором AAV2/9-pDCX-FerrH, что является важным для использования данного вектора в прижизненной визуализации нейрогенеза. Ответы на данные вопросы могут быть получена в дальнейших исследованиях при условии модификации существующего протокола получения и культивирования нейронов. Отдельного внимания заслуживает вопрос механизмов цитотоксичности вектора с трансгеном тяжелой цепи ферритина, которые могут быть объяснены индукцией особого типа клеточной гибели - ферроптоза, что требует дальнейших исследования для предупреждения отрицательных последствий в in vivo исследованиях.
Наше исследование может оказаться полезным при проведении дальнейших in vivo исследований, так как в нем была показана эффективность использования человеческого промотора даблкортина для специфической экспрессии трансгена в клетках мозга мыши, а также описана проблема влияния концентрации векторов на эффективность трансдукции и на выживаемость нейронов.

Купить