ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ТРАНСДУКЦИИ НЕЙРОНОВ В ПЕРВИЧНОЙ КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК ГОЛОВНОГО МОЗГА МЫШИ ВИРУСНЫМИ ВЕКТОРАМИ AAV2/9 С ТРАНСГЕНАМИ ПОД ПРОМОТОРОМ DCX
|
АННОТАЦИЯ 3
ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, СИМВОЛОВ, СОКРАЩЕНИЙ 4
ВВЕДЕНИЕ 6
1 Обзор литературы 8
1.1 Первичная культура нейронов 8
1.1.1 Модели первичной культуры нейронов 9
1.1.1.1 Первичные 2О-культуры нейронов 9
1.1.1.2 Первичные каркасные 3 D-культуры нейронов 10
1.1.1.3 Сфероидные 3D-культуры нейронов 12
1.1.1.4 Ex vivo культуры срезов мозга 14
1.1.1.5 Микрофлюидные технологии в первичной культуре нейронов 15
1.1.1.6 3D-биопринтинг 16
1.1.2 Среды и добавки для нейрональных культур 18
1.1.3 Специфические маркеры и развитие нейронов 22
1.2 Вирусные векторы и трансдукция клеток 28
1.2.1 Разнообразие и использование вирусных векторов для трансдукции клеток
нервной ткани 29
1.2.1.1 Аденоассоциированные векторы 30
1.2.1.2 Аденовирусные векторы 32
1.2.1.3 Герпесвирусные векторы 33
1.2.1.4 Ретровирусные векторы 35
1.2.1.5 Прочие вирусные векторы 36
1.2.2 Механизм и эффективность трансдукции AAV векторов 38
1.2.2.1 Прикрепление и интернализация AAV в клетку 38
1.2.2.2 Этап сортировки и цитоплазматического транспорта AAV 39
1.2.2.3 Ядерный импорт AAV 40
1.2.2.4 Синтез второй цепи ДНК и экспрессия трансгена 41
1.2.2.5 Эффективность трансдукции и определяющие ее факторы 42
1.3 Использование и перспективы AAV векторов для трансдукции нейронов in vivo и in
vitro 44
1.3.1 МРТ с репортерными генами для визуализации нейрогенных ниш 44
2 Материалы и методы 46
2.1 Экспериментальные животные и дизайн эксперимента 46
2.2 Конструкция вирусных векторов 46
2.3 Обработка и покрытие покровных стекол 47
2.4 Выделение кортикальных нейронов мыши 47
2.5 Засев и культивирование первичной культуры нейронов 49
2.6 Подсчет значения MOI и трансдукция нейронов 50
2.7 Выделение микроглии из смешанной глиальной культуры 50
2.8 Иммуноокрашивание и получение микрофотографий 50
2.9 Обработка изображений 52
2.10 Статистический анализ 52
3 Результаты и обсуждение 53
3.1 Иммуногистохимическое исследование срезов мозга мыши 53
3.2 Условия культивирования первичных постнатальных нейронов 55
3.3 Иммуноцитохимическое исследование трансдуцированных нейронов 57
3.4 Нейрональный состав первичной культуры постнатальных нейронов 59
3.5 Эффективность трансдукции нейронов двумя AAV-векторами 60
3.6 Детекция агрегаций железа в культурах нейронов 63
3.7 Анализ цитотоксичности AAV-векторов на 7 день после трансдукции 65
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 68
ВЫВОДЫ 69
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 70
ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, СИМВОЛОВ, СОКРАЩЕНИЙ 4
ВВЕДЕНИЕ 6
1 Обзор литературы 8
1.1 Первичная культура нейронов 8
1.1.1 Модели первичной культуры нейронов 9
1.1.1.1 Первичные 2О-культуры нейронов 9
1.1.1.2 Первичные каркасные 3 D-культуры нейронов 10
1.1.1.3 Сфероидные 3D-культуры нейронов 12
1.1.1.4 Ex vivo культуры срезов мозга 14
1.1.1.5 Микрофлюидные технологии в первичной культуре нейронов 15
1.1.1.6 3D-биопринтинг 16
1.1.2 Среды и добавки для нейрональных культур 18
1.1.3 Специфические маркеры и развитие нейронов 22
1.2 Вирусные векторы и трансдукция клеток 28
1.2.1 Разнообразие и использование вирусных векторов для трансдукции клеток
нервной ткани 29
1.2.1.1 Аденоассоциированные векторы 30
1.2.1.2 Аденовирусные векторы 32
1.2.1.3 Герпесвирусные векторы 33
1.2.1.4 Ретровирусные векторы 35
1.2.1.5 Прочие вирусные векторы 36
1.2.2 Механизм и эффективность трансдукции AAV векторов 38
1.2.2.1 Прикрепление и интернализация AAV в клетку 38
1.2.2.2 Этап сортировки и цитоплазматического транспорта AAV 39
1.2.2.3 Ядерный импорт AAV 40
1.2.2.4 Синтез второй цепи ДНК и экспрессия трансгена 41
1.2.2.5 Эффективность трансдукции и определяющие ее факторы 42
1.3 Использование и перспективы AAV векторов для трансдукции нейронов in vivo и in
vitro 44
1.3.1 МРТ с репортерными генами для визуализации нейрогенных ниш 44
2 Материалы и методы 46
2.1 Экспериментальные животные и дизайн эксперимента 46
2.2 Конструкция вирусных векторов 46
2.3 Обработка и покрытие покровных стекол 47
2.4 Выделение кортикальных нейронов мыши 47
2.5 Засев и культивирование первичной культуры нейронов 49
2.6 Подсчет значения MOI и трансдукция нейронов 50
2.7 Выделение микроглии из смешанной глиальной культуры 50
2.8 Иммуноокрашивание и получение микрофотографий 50
2.9 Обработка изображений 52
2.10 Статистический анализ 52
3 Результаты и обсуждение 53
3.1 Иммуногистохимическое исследование срезов мозга мыши 53
3.2 Условия культивирования первичных постнатальных нейронов 55
3.3 Иммуноцитохимическое исследование трансдуцированных нейронов 57
3.4 Нейрональный состав первичной культуры постнатальных нейронов 59
3.5 Эффективность трансдукции нейронов двумя AAV-векторами 60
3.6 Детекция агрегаций железа в культурах нейронов 63
3.7 Анализ цитотоксичности AAV-векторов на 7 день после трансдукции 65
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 68
ВЫВОДЫ 69
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 70
Нейрогенез у взрослых млекопитающих можно определить процесс генерации и развития новых нейронов из нейрональных предшественников в нейрогенных нишах. Наличие данного процесса с мозге взрослых млекопитающих является доказанным фактом с тех пор как несколько групп ученых продемонстрировали, что определенные зоны мозга различных видов обладают нейрогенным потенциалом. Взрослый нейрогенез может стать ключом к лечению широкого спектра нейродегенеративных и нервнопсихических заболеваний при более глубоком понимании механизмов, обеспечивающих регенерацию новых нейронов [Just et al., 2022].
Нейрогенез также может проявляться, как компенсаторный механизм при патологических состояниях, представляя собой сложный процесс, включающий миграцию нейрональных предшественников в очаги поражения и формирование новых нейрогенных ниш [Cardoso et al., 2021]. Для изучения данных процессов было бы удобно использовать высокоинформативные методы мечения клеток нейрогенных ниш и их прижизненной визуализации, сегодня же многие заключения и предположения и процессах нейрогенеза строятся на основе анализа ex vivo препаратов головного мозга [Khodanovich et al., 2020].
Магнитно-резонансная томография (МРТ) - это информативный метод, основанный на резонансных свойствах атомных ядер и который позволяет неинвазивно визуализировать анатомические структуры и физиологические процессы. Комбинация данного метода с трансдукцией - процессом переноса генетического материала в клетки с помощью вирусов - клеток мишеней и доставкой в них репортерных генов, которые могут прямо или косвенно продуцировать контрастные сигналы на МРТ является перспективным направлением для прижизненного изучения нейрогенных ниш млекопитающих [Gao et al., 2022].
Для проведения подобных исследований необходимо подобрать векторную конструкцию, которая будет эффективно трансдуцировать целевые клетки, не будет вызывать цитотоксичности и иммунного ответа, а также эффективно экспрессировать встроенный трансген длительное время. Во многом данным условиям удовлетворяют векторы на основе аденоассоциированного вируса [Li and Samulski, 2020].
Тестирование векторных конструкций для определения их эффективности наиболее наглядно и точно может быть проведено с использованием in vitro моделей, поэтому цель данной работы - оценить эффективность трансдукции DCX+ нейронов мыши (P1-2) векторами на основе аденоассоциированного вируса, несущими трансгены под промотором DCX человека in vitro.
В соответствие с целью были поставлены задачи:
1. Получение, культивирования и иммунофенотипирование первичной культуры нейронов головного мозга мыши.
2. Оценка эффективности трансдукции клеток векторами AAV2/9-pDCX-eGFP и AAV2/9-pDCX-FerrH на трех временных точках.
3. Анализ динамики процесса трансдукции и созревания трансдуцированных нейронов в течение одной недели .
В данной работе для анализа динамики процесса трансдукции были использованы генетические векторы на основе AAV. В качестве специфического промотора векторы содержали человеческий промотор даблкортина (DCX), в качестве трансгенов использовались последовательности зеленого флуоресцентного белка (eGFP) тяжелой цепи ферритина (FerrH), который может быть визуализирован на МРТ благодаря высокому содержанию железа.
Нейрогенез также может проявляться, как компенсаторный механизм при патологических состояниях, представляя собой сложный процесс, включающий миграцию нейрональных предшественников в очаги поражения и формирование новых нейрогенных ниш [Cardoso et al., 2021]. Для изучения данных процессов было бы удобно использовать высокоинформативные методы мечения клеток нейрогенных ниш и их прижизненной визуализации, сегодня же многие заключения и предположения и процессах нейрогенеза строятся на основе анализа ex vivo препаратов головного мозга [Khodanovich et al., 2020].
Магнитно-резонансная томография (МРТ) - это информативный метод, основанный на резонансных свойствах атомных ядер и который позволяет неинвазивно визуализировать анатомические структуры и физиологические процессы. Комбинация данного метода с трансдукцией - процессом переноса генетического материала в клетки с помощью вирусов - клеток мишеней и доставкой в них репортерных генов, которые могут прямо или косвенно продуцировать контрастные сигналы на МРТ является перспективным направлением для прижизненного изучения нейрогенных ниш млекопитающих [Gao et al., 2022].
Для проведения подобных исследований необходимо подобрать векторную конструкцию, которая будет эффективно трансдуцировать целевые клетки, не будет вызывать цитотоксичности и иммунного ответа, а также эффективно экспрессировать встроенный трансген длительное время. Во многом данным условиям удовлетворяют векторы на основе аденоассоциированного вируса [Li and Samulski, 2020].
Тестирование векторных конструкций для определения их эффективности наиболее наглядно и точно может быть проведено с использованием in vitro моделей, поэтому цель данной работы - оценить эффективность трансдукции DCX+ нейронов мыши (P1-2) векторами на основе аденоассоциированного вируса, несущими трансгены под промотором DCX человека in vitro.
В соответствие с целью были поставлены задачи:
1. Получение, культивирования и иммунофенотипирование первичной культуры нейронов головного мозга мыши.
2. Оценка эффективности трансдукции клеток векторами AAV2/9-pDCX-eGFP и AAV2/9-pDCX-FerrH на трех временных точках.
3. Анализ динамики процесса трансдукции и созревания трансдуцированных нейронов в течение одной недели .
В данной работе для анализа динамики процесса трансдукции были использованы генетические векторы на основе AAV. В качестве специфического промотора векторы содержали человеческий промотор даблкортина (DCX), в качестве трансгенов использовались последовательности зеленого флуоресцентного белка (eGFP) тяжелой цепи ферритина (FerrH), который может быть визуализирован на МРТ благодаря высокому содержанию железа.
В настоящей работе проведено исследование динамики процесса трансдукции культивируемых DCX+ нейронов постнатальной мыши двумя тканеспецифичными векторами на основе аденоассоциированного вируса: AAV2/9-pDCX-eGFP и AAV2/9- pDCX-FerrH. Полученные результаты показали различную степень эффективности трансдукции двух векторов на разных временных точках, при этом исследуемый фактор MOI (отношение количества вирусных частиц к количеству клеток в культуре) по результатам статистического анализа был охарактеризован, как не влияющий на эффективность трансдукции на рассматриваемых сроках (1-7 дней). В то же время результаты анализа цитотоксичности векторов на позднем сроке трансдукции показали отрицательный эффект высоких доз векторов на выживаемость нейронов в культуре. Неоднозначность результатов на 7 день после трансдукции для AAV-pDCX-eGFP может быть связана с гибелью клеток, опосредованной неблагоприятными культуральными условиями, а также чрезмерной трансдукцией, которая выражалась в “метаболической нагрузке” на нейроны (синтез трансгенного белка).
Во время выполнения исследовательской работы было проведено тестирование протокола первичной культуры постнатальных нейронов с параллельной оценкой его особенностей и недостатков, на основании чего были предложены предприняты попытки его модификации, что может оказаться полезным для проведения дальнейших работ, завязанных на in vitro моделях.
На используемой в нашем исследовании in vitro модели не удалось провести анализ более поздних стадий трансдукции нейронов, а также оценить эффективность накопления железа нейронами, трансдуцированными вектором AAV2/9-pDCX-FerrH, что является важным для использования данного вектора в прижизненной визуализации нейрогенеза. Ответы на данные вопросы могут быть получена в дальнейших исследованиях при условии модификации существующего протокола получения и культивирования нейронов. Отдельного внимания заслуживает вопрос механизмов цитотоксичности вектора с трансгеном тяжелой цепи ферритина, которые могут быть объяснены индукцией особого типа клеточной гибели - ферроптоза, что требует дальнейших исследования для предупреждения отрицательных последствий в in vivo исследованиях.
Наше исследование может оказаться полезным при проведении дальнейших in vivo исследований, так как в нем была показана эффективность использования человеческого промотора даблкортина для специфической экспрессии трансгена в клетках мозга мыши, а также описана проблема влияния концентрации векторов на эффективность трансдукции и на выживаемость нейронов.
Во время выполнения исследовательской работы было проведено тестирование протокола первичной культуры постнатальных нейронов с параллельной оценкой его особенностей и недостатков, на основании чего были предложены предприняты попытки его модификации, что может оказаться полезным для проведения дальнейших работ, завязанных на in vitro моделях.
На используемой в нашем исследовании in vitro модели не удалось провести анализ более поздних стадий трансдукции нейронов, а также оценить эффективность накопления железа нейронами, трансдуцированными вектором AAV2/9-pDCX-FerrH, что является важным для использования данного вектора в прижизненной визуализации нейрогенеза. Ответы на данные вопросы могут быть получена в дальнейших исследованиях при условии модификации существующего протокола получения и культивирования нейронов. Отдельного внимания заслуживает вопрос механизмов цитотоксичности вектора с трансгеном тяжелой цепи ферритина, которые могут быть объяснены индукцией особого типа клеточной гибели - ферроптоза, что требует дальнейших исследования для предупреждения отрицательных последствий в in vivo исследованиях.
Наше исследование может оказаться полезным при проведении дальнейших in vivo исследований, так как в нем была показана эффективность использования человеческого промотора даблкортина для специфической экспрессии трансгена в клетках мозга мыши, а также описана проблема влияния концентрации векторов на эффективность трансдукции и на выживаемость нейронов.
