МОЛЕКУЛЯРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ РАЙОНОВ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ Х-ХРОМОСОМЫ ЯДЕРНОЙ ЛАМИНОЙ В ТРОФОЦИТАХ ANOPHELES ATROPARVUS

Введение 4
1 Обзор литературы 6
1.1 Пространственная организация ядра 6
1.2 Районы прикрепления хромосом к ядерной оболочке 7
1.2.1 Ядерная ламина. Состав и строение ядерной ламины 7
1.2.2 Молекулярно-генетический состав районов прикрепления 8
1.2.2.1 Ламин-ассоциированные домены 8
1.2.2.2 S/MAR-последовательности 10
1.2.3 Молекулярная организация гетерохроматина 11
1.2.3.1 Молекулярное строение гетерохроматина 11
1.4 Пространственная организация хромосом у малярийных комаров 14
1.5 Межвидовые различия пространственной организации хромосом в трофоцитах 16
яичников у малярийных комаров
1.5.1 Хромосома 2 17
1.5.2 Хромосома 3 17
1.5.3 Половая Х-хромосома 18
2 Материалы и методы 21
2.1 Описание объекта исследования 21
2.2 Фиксация материала 21
2.3 Приготовление сухо-воздушных препаратов хромосом 21
2.4 Микродиссекция районов на хромосоме 21
2.5 Приготовление зондов для FISH c Х-хромосомой методом ПНР 22
2.6 Электрофорез в агарозном геле 23
2.7 Флуоресцентная in situ гибридизация (FISH) 23
2.8 Микроскопический анализ результатов флуоресцентной in situ гибридизации 24
2.9 Разработка праймеров 25
2.10 Приготовление праймеров методом ПЦР 25
2.11 Мечение ДНК-зондов для FISH методом Random Primer с использованием 25 фрагмента Кленова
2.12 Локализация ДНК-зондов праймеров с помощью FISH 25
2.13 Анализ молекулярно-генетического состава ДНК-последовательностей 26
3 Результаты и обсуждение 28
3.1 Результаты микродиссекции районов взаимодействия Х-хромосомы с ядерной 28 ламиной у An. beklemishevi, An. atroparvus и An. messeae
3.2 Результаты in situ гибридизации ДНК районов An. beklemishevi c Х-хромосомами 28 An. atroparvus и An. messeae
3.3 Результаты in situ гибридизации ДНК районов An. atroparvus c Х-хромосомой An. 28 messeae
3.4 Результаты in situ гибридизации ДНК районов An. messeae c Х-хромосомой An. 29
atroparvus
3.5 Анализ межвидовых различий в локализации контактов Х-хромосомы с ядерной 30 ламиной у An.messeae, An. atroparvus и An. beklemishevi
3.6 Анализ морфологических особенностей районов прикрепления хромосом к 33
ядерной оболочке
3.7 Анализ молекулярно-генетического состава районов связывания ламина В 34
Х-хромосомы An. atroparvus
Выводы 36
Литература 37

Купить

В последние десятилетия все больше и больше внимания уделяется изучению пространственной организации ядра (Стегний 1979, 1987). Особое значение имеет изучение пространственной организации в период интерфазы, когда расположение хромосом играет важную роль. В свою очередь, пространственная организация генетического материала в ядре интересна не только с точки зрения выявления механизмов регуляции экспрессии генов, но и в исследовании функционирования тканей, органов и в эволюционном аспекте (Стегний и др., 2007; Cremer et al., 2010; Rouquette et al., 2010).
Упорядоченная трехмерная структура ядра обеспечивается взаимодействием хромосом с ядерной оболочкой и друг с другом (Куличков и др., 1979). Интерес представляет исследование молекулярной организации районов хромосом, имеющих прикрепление к ядерной оболочке (Артемов и др., 2011). Установление природы взаимодействия хромосом с ядерной оболочкой даст представление о механизмах формирования и функционирования хроматина в пространстве ядра, как в разных тканях, так и у разных видов (Артемов и др., 2011).
Важным аспектом в изучении в организации хроматина в ядре является ядерная ламина. Ламины и множество других белков ядерной ламины могут взаимодействовать с ДНК, гистонами, факторами транскрипции, и белками хроматина (Prokocimer et al., 2009; Taddei et al., 2004). Накапливаются доказательства того, что ламины используются не только для заяко- ривания хроматина, но и непосредственно участвуют в подавлении экспрессии генов (Peric-Hupkes et al., 2010).
Клетки с политенными хромосомами дают большие возможности для изучения хромосомных перестроек (таких как инверсии), изучения механизмов прикрепления и механизмов эволюции системы прикреплений у близкородственных видов и видообразования (Стегний, 1993).
Для изучения этих и ряда других вопросов интересным объектом являются малярийные комары комплекса "maculipennis", имеющие политенные хромосомы в клетках соматической и генеративной систем. Исследования клеток генеративной системы помогают в решении вопросов наследования упорядоченности хромосом, так как архитектура политенных хромосом в ядрах трофоцитов малярийных комаров является видоспецифичным признаком.
Было показано, что в трофоцитах яичников малярийных комаров хромосомы обладают выраженными прикреплениями к ядерной оболочке, которые можно видеть даже в световой микроскоп (Стегний, 1979, 1993). Для малярийных комаров комплекса «maculipennis», были выявлены межвидовые различия по наличию или отсутствию прикрепления у отдельных хромосом, по локализации районов прикрепления на хромосоме и по морфологическим характеристикам этих районов. Позже, с помощью иммуноокрашивания антителами к ламину В, обнаружили особенности локализации районов взаимодействия хромосом с ядерной ламиной (Артемов и др., 2013). Таким образом, было показано изменение системы взаимодействий Х-хромосомы с ядерной ламиной у трех близкородственных видов малярийных комаров в ходе эволюции.
Существует несколько механизмов, определяющих неслучайное расположение хромосом в пространстве ядра (Kind et al., 2014). Одним из таких механизмов позиционирования в ядре является связь с отдельными ядерными структурами, например, с ядерной ламиной. Она играет важную роль в заякоривании больших областей хроматина, которые называются ла- мин-ассоциированными доменами (ЛАД). Определение и изучение молекулярно-генетического состава конститутивных ЛАДов у близких видов поможет продвинуться в понимании механизмов прикрепления, и ответить на вопрос, как пространственная организация хромосом в ядре может быть связана с видообразованием (Широкова и др., 2015).
Целью данной работы было определить, расположены ли районы взаимодействия X-хромосомы с ядерной ламиной трофоцитов в гомеологичных районах у трех видов малярийных комаров: Anopheles atroparvus, An. messeae, An. Beklemishevi, а также охарактеризовать молекулярно-генетический состав эволюционно консервативных районов контактов хромосом с ядерной оболочкой.
Были поставлены следующие задачи:
1. Микродиссектировать районы прикрепления Х-хромосомы An. beklemishevi, An. atroparvus и An. messeae, связанные с ламином В в трофоцитах, и провести флуоресцентную in situ гибридизацию для определения гомеологичных районов An. beklemishevi, An. atroparvus и An. messeae.
2. Определить, сохраняют ли гомеологичные районы Х-хромосомы An. beklemishevi, An. atroparvus и An. messeae взаимодействие с ядерной ламиной.
3. Определить содержание генов, мобильных генетических элементов и S/MAR последовательностей, а также сравнить полученные результаты со средним по Х-хромосоме
4. Сделать выводы о связи молекулярно-генетического состава хромосомы с пространственной организацией ядра
Работа была выполнена в лаборатории эволюционной цитогенетики НИИББ. Выражаю благодарность кандидату биологических наук, Артемову Глебу Николаевичу за помощь на всех этапах выполнения работы.

Купить