Актуальность проблемы.
В конце прошлого века были получены первые данные о профилях активности, общей численности и разнообразии форм микроорганизмов в глубинных слоях морских осадочных отложений, которые стали реальным доказательствами гипотезы о существовании глубинной биосферы (Cragg et al., 1990; Gold, 1992).
Глубинная биосфера Земли, как мы знаем сегодня, должна включать в себя различные подземные среды обитания, такие как водоносные горизонты и осадочные породы, а также отложения и изверженные породы в морских глубинах. Подземная биосфера может быть горячей, как в океанической коре, и может быть холодной, как в морских отложениях вблизи морского дна. Текущие оценки показывают, что от 1/2 до 2/3 всей биомассы на Земле находится в глубинной биосфере (Whitman, Coleman, Wiebe, 1998).
За последние десятилетия изучение донных отложений и пород в океане и на континенте показало огромное разнообразие бактериальных сообществ. Микроорганизмы, большинство из которых не имеют культивируемых или известных родственников в поверхностной биосфере, были обнаружены в отложениях и скальных породах на глубине до 1 км ниже морского дна и более 3 км в глубине континентальной коры (Fang, Zhang, 2011). Все микроорганизмы подземных сообществ являются частью процессов биосферы в целом (Parkes et al., 2014). Глубинная биосфера содержит в себе огромное количество уникальных бактериальных сообществ, архей и грибов.
Глубинная биосфера - это одно из немногих мест на Земле, где похожая физическая среда, например: осадок, находится под воздействием разных геохимических и геотермальных условий. Например, температура отложений в одной пробуренной скважине изменяется с глубиной от 2°C до 50°C в зависимости от уровня погружения (Parkes et al., 2000). Температурные градиенты часто бывают постепенными в подземном биоме по сравнению со средами на поверхности земли, где существуют экстремальные градиенты в пределах нескольких сантиметров. Это позволяет более тщательно экспериментировать с влиянием тепловых градиентов на эволюцию в микробных сообществах, которая может происходить медленно в течение тысячелетий.
В глубинной биосфере также встречаются сульфатредуцирующие бактерии в анаэробных зонах морских и континентальных водоемов, подземных водах нефтяных месторождений и других экосистемах (Сорокин, 1968; Кузнецов, 1970; Gibson G.R.,1990).
Новые микроорганизмы из подземной биосферы, ранее неизвестные, могут обладать новыми свойствами, которые позволят решить ряд биотехнологических задач. Например, как в биотехнологии используются сульфатредуцирующие бактерии, являющиеся эффективными при осаждении тяжелых металлов из различных загрязненных сред (Gadd, 2000). Использование биологических процессов при осаждении металлов имеет ряд преимуществ перед стандартными физико-химическими процессами. Сульфиды металлов являются более стабильными и химически инертными соединениями, чем гидроксиды, образующиеся после химической обработки. Кроме того, биологически осажденные сульфиды металлов могут быть преобразованы и использованы в последующих процессах. Очистка загрязненных сред, содержащих сульфат и растворенные тяжелые металлы, с помощью биологической сульфатредукции является перспективным методом (Katsutaka, 1988; Cowling et al., 1992; Dvorak et al., 1992; Barnes et al., 1994; Hammack et al., 1992; Christensen et al., 1996; Chang et al., 2000).
Глубинная биосфера уникальна. Во-первых, из-за крайне медленных темпов роста большинство глубинных биосферных микроорганизмов, так как они плохо поддаются культивированию (Jorgensen et al., 2007). Таким
образом, разнообразие микроорганизмов может быть серьезно недооценено из-за технических и других трудностей в отборе проб, выделении и культивировании этих организмов. Характеристика бактериальных сообществ основана главным образом на количестве клеток, предполагаемой активности и 16S рРНК. Многие прокариоты в естественной среде не растут на стандартных лабораторных средах, поскольку сложные условия естественной среды обитания трудно воспроизвести. Таким образом, как правило, менее 0,6% от общего числа клеток в глубоких отложениях было обнаружено путем культивирования (Cragg et al., 1990, 1996; Barnes et al., 1998; Parkes et al., 2000). Бактерии были обогащены и изолированы различными органическими соединениями при разных температурах (Bale et al., 1997; Barnes et al., 1998; Inagaki et al., 2003; Mikucki et al., 2003; Toffin et al., 2004, 2005 ; Biddle et al., 2005; Lee et al., 2005; Kobayashi et al., 2008; Parkes et al., 2009). Таким образом, необходимо разрабатывать новые методы выращивания и среды для имитации окружающей среды глубокой биосферы.
Целью данной работы является изучение физиологических особенностей чистых культур полученных из подземной биосферы.
В соответствии с поставленной целью были сформулированы
следующие задачи:
1. Определить диапазон температур, позволяющий рост штамма BuA, BuBC.
2. Определить оптимальное значение температуры для роста выбранного штамма.
3. Выделить чистую культуру бактерий из накопительной культуры RBS-3.
4. Изучить способность штаммов RBS-3 и BuBC расти на разных субстратах.
5. Определить филогенетическое положение штаммов BuA, RBS-3 и BuBC.
Работа выполнена на базе лаборатории биохимии и молекулярной биологии при кафедре физиологии растений и биотехнологии Биологического института Национального исследовательского Томского государственного университета.
Автор выражает благодарность научному руководителю старшему преподавателю Д.В. Анциферову за руководство и заведующей кафедрой физиологии растений и биотехнологии Томского государственного университета доктору биологических наук, профессору О.В. Карначук за возможность выполнять исследования на высоком методологическом уровне. Автор признателен А.П. Лукиной за помощь при проведении экспериментов и предоставление материала для исследований. А также всему коллективу кафедры физиологии растений и биотехнологии НИ ТГУ за оказанную поддержку и помощь.
1. Диапазон температур, позволяющий рост штамма BuA составил от 37°С до 65°С с оптимумом 50°С.
2. Диапазон температур, позволяющий рост штамма BuBC составил
от 37°С до 65°С. Для определения верхнего предела необходимы дополнительные исследования.
3. Получена морфологически однородная культура клеток из
накопительной культуры RBS-3 на пропионате. На основе филогенетического анализа была отнесена к роду Desulfovibrio.
4. Показан рост штамма RBS-3 на таких субстратах как: пропионат, формиат, бутират и водород.
5. Показан рост штамма BuBC на разных субстратах: лактат, глицерин, сахароза, манноза, глюкоза, фруктоза.
6. Филогенетический анализ последовательностей гена 16 зРНК отнес штамм BuA к роду Desulfotomaclum.
1. Громов Б.В., Павленко Г.В. Экология бактерий // ЛГУ -1989.-C. 246.
2. Джей Дж.М., Лёсснер М.Дж., Гольден Д.А. Современная пищевая
микробиология; пер. 7-го англ. изд. - 2-е изд. (эл.). - М.: БИНОМ.
Лаборатория знаний, 2014. - 886 с.
3. Еремина И.А. Микробиология: Учебное пособие для студентов ВУЗов. 2-е изд. перер. и доп. - Кемерово, КемТИПП, 2007.-112 с
4. Заварзин Г.А. Становление биосферы. // Вестник РАН. 2001. Т. 71. №11. С. 9881001.
5. Зайнуллин Х. Н., Смирнова Г. Ф. и др. Применение сульфатвосстанавливающих бактерий для биохимической очистки сточных вод машиностороительных предприятий // Химия и технология воды. 1980. т.2. No 3. -С. 272-275.
6. Емцев В. Т., Мишустин Е. Н. Микробиология: учебник для вузов /. — 5-е изд., перераб. и доп. — М. : Дрофа, 2005. — 445, [3] с.
7. Шеховцова Н.В. Экология водных микроорганизмов: учебное пособие; Яросл. гос. ун-т.-Ярославль: ЯрГУ, 2008.-132 с.
8. Шлегель Г. Общая микробиология: Пер. с нем. - М.: Мир, 1987. - С. 567.
9. Adams, M.W.W., F.B. Perler, and R.M. Kelly. Extremozymes: expanding the limits of biocatalysis. Bio/Technology. 1995. 13: 662-668.
10. Bale, S. J., Goodman, K., Rochelle, P. A., Marches!, J. R., Fry, J. C., Weightman, A. J., and Parkes, R. J. Desulfovibrio profundus sp. nov., a novel barophilic sulfate-reducing bacteria from deep sediments layers in the Japan Sea. International Journal of Systematic Bacteriology. 1997. 47, 515-521.
11. Balk M, Weijma J, Stams AJ. Thermotoga lettingae sp. nov., a novel thermophilic, methanol-degrading bacterium isolated from a thermophilic anaerobic reactor. Int J Syst Evol Microbiol. 2002. 52:1361-1368.
12. Barnes, S.J., Makovicky, E., Karup-Moller, S., Makovicky, M. and Rose-Hansen, J. Partition coefficients for Ni, Cu, Pd, Pt, Rh and Ir between monosulphide solid solution and sulphide liquid and the implications for the formation of compositionally zoned Ni-Cu sulphide bodies by fractional crystallization of sulphide liquid. Mineralogical Magazine. 1994. 58: 51-52.
13. Barnes, S. P., Bradbrook, S. D., Cragg, B. A., Marchesi, J. R., Weightman, A. J., Fry, J. C., and Parkes, R. J. Isolation of sulfate-reducing bacteria from deep sediment layers of the Pacific Ocean. Geomicrobiology Journal. 1998. 15, 67¬83.
14. Barton L.L., Tomei F.A. Characteristics and activities of sulfate-reducing bacteria // Sulfate-reducing bacteria (L.L.Barton,eds.). New York: Plenum Press, 1995.-P.1-32.
15. Beijerinck W.M. Uber Spirillum desulphuricans als Ursache von
Sulfatreduktion. // Zentralb. Bakteriol. Parasitk. Infekt. Abt. II. 1895. V.1. -
P.49-59... 113