📄Работа №187422
Тема: ВИЗУАЛИЗАЦИЯ НЕЙРОГЕНЕЗА МЕТОДОМ MPT С ПРИМЕНЕНИЕМ ГЕНЕТИЧЕСКОГО ВЕКТОРА
Тип работы
Бакалаврская работа
Предмет
биология
Объем:
91 листов
Год:
2020
Просмотров:
52
4245
руб.
🛒 Купить работу
Не подходит эта работа?
Закажите новую по вашим требованиям
Узнать цену на написание
Закажите новую по вашим требованиям
Представленный материал является образцом учебного исследования, примером структуры и содержания учебного исследования по заявленной теме. Размещён исключительно в информационных и ознакомительных целях.
Workspay.ru оказывает информационные услуги по сбору, обработке и структурированию материалов в соответствии с требованиями заказчика.
Размещение материала не означает публикацию произведения впервые и не предполагает передачу исключительных авторских прав третьим лицам.
Материал не предназначен для дословной сдачи в образовательные организации и требует самостоятельной переработки с соблюдением законодательства Российской Федерации об авторском праве и принципов академической добросовестности.
Авторские права на исходные материалы принадлежат их законным правообладателям. В случае возникновения вопросов, связанных с размещённым материалом, просим направить обращение через форму обратной связи.
Настоящий учебно-методический информационный материал размещён в ознакомительных и исследовательских целях и представляет собой пример учебного исследования. Не является готовым научным трудом и требует самостоятельной переработки.
📋 Содержание
Перечень сокращений и условных обозначений 6
Введение 8
1 Обзор литературы 11
1.1 Постнатальный нейрогенез 11
1.1.1 Определение и общая характеристика постнатального нейрогенеза 11
1.1.2 Процесс образования новых нейронов 13
1.1.3 Регуляция процессов постнатального нейрогенеза 15
1.1.4 Визуализация и оценка нейрогенеза с помощью специфических маркеров 18
1.2 Методы неинвазивной нейровизуализации 20
1.2.1 МРТ как метод визуализации нейрогенеза 23
1.2.2 Физические основы МРТ 23
1.2.3 Параметры МРТ 30
1.2.4 Импульсные последовательности МРТ 32
1.2.5 Использование репортерных генов в МРТ 36
1.2.5.1 Общая характеристика репортерных генов 36
1.2.5.2 FerrH как репортерный ген МРТ 36
1.2.5.3 Вирусные векторные системы доставки репортерного гена 37
2 Материалы и методы исследования 39
2.1 Экспериментальные животные 39
2.2 Используемое оборудование 39
2.3 Используемые реактивы 40
2.4 Используемые векторы 41
2.5 Протокол МРТ-сканирования 41
2.6 Методика исследования 42
2.6.1 Подготовка экспериментальных животных к операции 42
2.6.2 Интракраниальная инъекция 42
2.6.3 Вывод животных из эксперимента 44
2.6.4 МРТ-сканирование на томографе Philips Achieva 1.5T 44
2.6.5 Обработка данных 45
2.6.6 Изготовление срезов головного мозга 45
2.6.7 Иммуногистохимическое окрашивание 45
2.6.8 Детекция белков генов-репортеров 46
2.6.9 Оценка результатов 47
2.6.10 Оценка статистической значимости результатов 47
3 Результаты и обсуждение 48
3.1.1 Оптимизация интракраниальных инъекций 48
3.1.2 Сравнение неспецифических векторов LV-FUGW-eGFP, AAV2/9-CMV-
eGFP, LV-CMV-TagGFP2 и LV-CMV-FerrH в отношении эффективности
трансфекции клеток головного мозга 51
3.2 Визуализация нейрогенеза посредством вирусных векторов, содержащих
трансгены FerrH и eGFP под промоторами даблкортина и цитомегаловируса AAV-DCX-FerrH, LV-DCX-eGFP-T2A-FerrH и LV-CMV-eGFP-T2A-FerrH 55
3.2.1 Определение сроков эффективности экспрессии в in vivo векторов, содержащих трансгены eGFP и FerrH под промоторами даблкортина и цитомегаловируса AAV-DCX-FerrH, LV-DCX-eGFP-T2A-FerrH и LV-CMV-eGFP-T2A-FerrH 56
3.2.2 Сравнение векторов, содержащих трансгены eGFP и FerrH под
промоторами даблкортина и цитомегаловируса AAV-DCX-FerrH, LV-DCX-eGFP-T2A-FerrH и LV-CMV-eGFP-T2A-FerrH, в отношении эффективности и специфичности заражения молодых нейронов 60
3.2.2.1 Перекрестная специфичность векторов, содержащих трансгены eGFPи FerrH под промоторами даблкортина и цитомегаловируса AAV-DCX-FerrH, LV-DCX-eGFP-T2A-FerrH и LV-CMV-eGFP-T2A-FerrH, в отношении клеток другого типа 61
3.2.3 МРТ-визуализация экспрессии гена-репортера FerrH, опосредованной векторами AAV-DCX-FerrH, LV-DCX-eGFP-T2A-FerrH и LV-CMV-eGFP-T2A- FerrH, в ex vivo 66
3.2.3.1 Иммунногистохимическая валидация МРТ-изображений, полученных
на томографе Philips Acheiva 1.5T головного мозга крысы ex vivo 69
Заключение 77
Выводы 78
Список литературы 79
Введение 8
1 Обзор литературы 11
1.1 Постнатальный нейрогенез 11
1.1.1 Определение и общая характеристика постнатального нейрогенеза 11
1.1.2 Процесс образования новых нейронов 13
1.1.3 Регуляция процессов постнатального нейрогенеза 15
1.1.4 Визуализация и оценка нейрогенеза с помощью специфических маркеров 18
1.2 Методы неинвазивной нейровизуализации 20
1.2.1 МРТ как метод визуализации нейрогенеза 23
1.2.2 Физические основы МРТ 23
1.2.3 Параметры МРТ 30
1.2.4 Импульсные последовательности МРТ 32
1.2.5 Использование репортерных генов в МРТ 36
1.2.5.1 Общая характеристика репортерных генов 36
1.2.5.2 FerrH как репортерный ген МРТ 36
1.2.5.3 Вирусные векторные системы доставки репортерного гена 37
2 Материалы и методы исследования 39
2.1 Экспериментальные животные 39
2.2 Используемое оборудование 39
2.3 Используемые реактивы 40
2.4 Используемые векторы 41
2.5 Протокол МРТ-сканирования 41
2.6 Методика исследования 42
2.6.1 Подготовка экспериментальных животных к операции 42
2.6.2 Интракраниальная инъекция 42
2.6.3 Вывод животных из эксперимента 44
2.6.4 МРТ-сканирование на томографе Philips Achieva 1.5T 44
2.6.5 Обработка данных 45
2.6.6 Изготовление срезов головного мозга 45
2.6.7 Иммуногистохимическое окрашивание 45
2.6.8 Детекция белков генов-репортеров 46
2.6.9 Оценка результатов 47
2.6.10 Оценка статистической значимости результатов 47
3 Результаты и обсуждение 48
3.1.1 Оптимизация интракраниальных инъекций 48
3.1.2 Сравнение неспецифических векторов LV-FUGW-eGFP, AAV2/9-CMV-
eGFP, LV-CMV-TagGFP2 и LV-CMV-FerrH в отношении эффективности
трансфекции клеток головного мозга 51
3.2 Визуализация нейрогенеза посредством вирусных векторов, содержащих
трансгены FerrH и eGFP под промоторами даблкортина и цитомегаловируса AAV-DCX-FerrH, LV-DCX-eGFP-T2A-FerrH и LV-CMV-eGFP-T2A-FerrH 55
3.2.1 Определение сроков эффективности экспрессии в in vivo векторов, содержащих трансгены eGFP и FerrH под промоторами даблкортина и цитомегаловируса AAV-DCX-FerrH, LV-DCX-eGFP-T2A-FerrH и LV-CMV-eGFP-T2A-FerrH 56
3.2.2 Сравнение векторов, содержащих трансгены eGFP и FerrH под
промоторами даблкортина и цитомегаловируса AAV-DCX-FerrH, LV-DCX-eGFP-T2A-FerrH и LV-CMV-eGFP-T2A-FerrH, в отношении эффективности и специфичности заражения молодых нейронов 60
3.2.2.1 Перекрестная специфичность векторов, содержащих трансгены eGFPи FerrH под промоторами даблкортина и цитомегаловируса AAV-DCX-FerrH, LV-DCX-eGFP-T2A-FerrH и LV-CMV-eGFP-T2A-FerrH, в отношении клеток другого типа 61
3.2.3 МРТ-визуализация экспрессии гена-репортера FerrH, опосредованной векторами AAV-DCX-FerrH, LV-DCX-eGFP-T2A-FerrH и LV-CMV-eGFP-T2A- FerrH, в ex vivo 66
3.2.3.1 Иммунногистохимическая валидация МРТ-изображений, полученных
на томографе Philips Acheiva 1.5T головного мозга крысы ex vivo 69
Заключение 77
Выводы 78
Список литературы 79
📖 Введение
В условиях современной жизни постоянно возрастает число случаев возникновения нейродегенеративных заболеваний и других нарушений, приводящих к патологическим изменениям нервной системы [1-3], поэтому такие заболевания представляют собой одну из важнейших медицинских и социальных проблем. Это обусловлено как тяжелой физической и психологической инвалидизацией, так и возраст-зависимым характером таких заболеваний, проявляющихся чаще всего у лиц старше 50 лет [4, 5], что, в связи с увеличением продолжительности жизни, неизбежно ведет к возрастанию числа таких пациентов и ухудшению качества жизни.
В клинической картине многих заболеваний головного мозга (например, ишемического инсульта) присутствует значительная гибель нейронов в различных его областях [6, 7]. В связи с этим все больший интерес ученых вызывает существование нейрональной пластичности как возможности частичного восстановления тех или иных функций за счет регенерации структур мозга после его повреждений, а, следовательно, и повышения качества жизни больных [8].
Относительно недавно установлено, что последующие за гибелью нейронов процессы нейрогенеза способствуют восстановлению головного мозга [9], в связи с чем в настоящее время активно ведутся многочисленные исследования по изучению постанатального нейрогенеза — феномена регенерации нейронов во взрослом мозге млекопитающих, в том числе — человека, который осуществляется в нескольких зонах головного мозга — нейрогенных нишах [8, 10].
Актуальность данного исследования определяется тем, что при лечении нейродегенеративных заболеваний необходимо использование методов прижизненной диагностики, которые могут быть только неинвазивными. Одним из наиболее удобных таких методов является магнитно-резонансная томография 8
(МРТ) [11, 12]. Как правило, именно с помощью этого метода обследуют пациентов с подозрением на нарушения в функционировании головного мозга, возникающие при различных нейродегенеративных заболеваниях [12]. Одним из способов визуализации нейрогенеза у животных на МРТ является использование особых репортерных генов, которые доставляются в выбранную область головного мозга посредством векторных систем [13].
В настоящем исследовании проводилась визуализация нейрогенеза у здоровых крыс методом МРТ в области субвентрикулярной зоны (subventricular zone, SVZ) боковых желудочков головного мозга. В качестве генов-репортеров использовались гены тяжелой цепи человеческого ферритина (FerrH) и зеленого флуоресцентного белка (green fluorescent protein, GFP), а в качестве систем их доставки было выбрано несколько вирусных векторов.
Своевременная и правильная диагностика, которая может быть проведена при помощи метода, предлагаемого в нашей работе, поможет существенно снизить возникновение многочисленных осложнений, которые возникают при неправильной постановке диагноза многих заболеваний, связанных с нарушениями функционирования головного мозга, а также изменить подходы к их лечению и поддерживающей терапии.
Объектом настоящего исследования является постнатальный нейрогенез.
Предмет настоящего исследования — МРТ-визуализация экспрессии гена- репортера FerrH в молодых нейронах.
Целью настоящего исследования является МРТ-визуализация экспрессии гена-репортера FerrH в молодых нейронах, отражающей нейрогенез, после интракраниальных микроинъекций генетических векторов.
В соответствии с поставленной целью в настоящей работе решается следующий ряд задач:
1. Оптимизация интракраниальных инъекций, сравнение неспецифических векторов LV-FUGW-eGFP, AAV2/9-CMV-eGFP, LV-CMV-TagGFP2 и LV-CMV- FerrH в отношении эффективности трансфекции клеток головного мозга.
2. Определение сроков эффективности экспрессии в in vivo векторов, содержащих трансгены eGFP и FerrH под промоторами даблкортина и цитомегаловируса AAV-DCX-FerrH, LV-DCX-eGFP-T2A-FerrH и LV-CMV-eGFP- T2A-FerrH.
3. Сравнение векторов, содержащих трансгены eGFP и FerrH под промоторами даблкортина и цитомегаловируса AAV-DCX-FerrH, LV-DCX-eGFP- T2A-FerrH и LV-CMV-eGFP-T2A-FerrH, в отношении эффективности и специфичности заражения молодых нейронов.
4. МРТ-визуализация экспрессии гена-репортера FerrH, опосредованной векторами AAV-DCX-FerrH, LV-DCX-eGFP-T2A-FerrH и LV-CMV-eGFP-T2A- FerrH, в ex vivo, с последующей гистологической валидацией.
В клинической картине многих заболеваний головного мозга (например, ишемического инсульта) присутствует значительная гибель нейронов в различных его областях [6, 7]. В связи с этим все больший интерес ученых вызывает существование нейрональной пластичности как возможности частичного восстановления тех или иных функций за счет регенерации структур мозга после его повреждений, а, следовательно, и повышения качества жизни больных [8].
Относительно недавно установлено, что последующие за гибелью нейронов процессы нейрогенеза способствуют восстановлению головного мозга [9], в связи с чем в настоящее время активно ведутся многочисленные исследования по изучению постанатального нейрогенеза — феномена регенерации нейронов во взрослом мозге млекопитающих, в том числе — человека, который осуществляется в нескольких зонах головного мозга — нейрогенных нишах [8, 10].
Актуальность данного исследования определяется тем, что при лечении нейродегенеративных заболеваний необходимо использование методов прижизненной диагностики, которые могут быть только неинвазивными. Одним из наиболее удобных таких методов является магнитно-резонансная томография 8
(МРТ) [11, 12]. Как правило, именно с помощью этого метода обследуют пациентов с подозрением на нарушения в функционировании головного мозга, возникающие при различных нейродегенеративных заболеваниях [12]. Одним из способов визуализации нейрогенеза у животных на МРТ является использование особых репортерных генов, которые доставляются в выбранную область головного мозга посредством векторных систем [13].
В настоящем исследовании проводилась визуализация нейрогенеза у здоровых крыс методом МРТ в области субвентрикулярной зоны (subventricular zone, SVZ) боковых желудочков головного мозга. В качестве генов-репортеров использовались гены тяжелой цепи человеческого ферритина (FerrH) и зеленого флуоресцентного белка (green fluorescent protein, GFP), а в качестве систем их доставки было выбрано несколько вирусных векторов.
Своевременная и правильная диагностика, которая может быть проведена при помощи метода, предлагаемого в нашей работе, поможет существенно снизить возникновение многочисленных осложнений, которые возникают при неправильной постановке диагноза многих заболеваний, связанных с нарушениями функционирования головного мозга, а также изменить подходы к их лечению и поддерживающей терапии.
Объектом настоящего исследования является постнатальный нейрогенез.
Предмет настоящего исследования — МРТ-визуализация экспрессии гена- репортера FerrH в молодых нейронах.
Целью настоящего исследования является МРТ-визуализация экспрессии гена-репортера FerrH в молодых нейронах, отражающей нейрогенез, после интракраниальных микроинъекций генетических векторов.
В соответствии с поставленной целью в настоящей работе решается следующий ряд задач:
1. Оптимизация интракраниальных инъекций, сравнение неспецифических векторов LV-FUGW-eGFP, AAV2/9-CMV-eGFP, LV-CMV-TagGFP2 и LV-CMV- FerrH в отношении эффективности трансфекции клеток головного мозга.
2. Определение сроков эффективности экспрессии в in vivo векторов, содержащих трансгены eGFP и FerrH под промоторами даблкортина и цитомегаловируса AAV-DCX-FerrH, LV-DCX-eGFP-T2A-FerrH и LV-CMV-eGFP- T2A-FerrH.
3. Сравнение векторов, содержащих трансгены eGFP и FerrH под промоторами даблкортина и цитомегаловируса AAV-DCX-FerrH, LV-DCX-eGFP- T2A-FerrH и LV-CMV-eGFP-T2A-FerrH, в отношении эффективности и специфичности заражения молодых нейронов.
4. МРТ-визуализация экспрессии гена-репортера FerrH, опосредованной векторами AAV-DCX-FerrH, LV-DCX-eGFP-T2A-FerrH и LV-CMV-eGFP-T2A- FerrH, в ex vivo, с последующей гистологической валидацией.
✅ Заключение
В настоящей работе был визуализирован нейрогенез у здоровых крыс методом сканирования МРТ с применением генетического вектора. Установлено, что генетические векторы на основе аденоассоциированных вирусов и лентивирусов, инвестированные интракраниально в нейрогенную зону SVZ, экспрессируют репортерные гены eGFP и FerrH в тканях головного мозга животного в зависимости от конструкции, а именно — вида промотора: специфического или неспецифического. Об этом свидетельствуют результаты сравнительного иммуногистохимического анализа препаратов срезов головного мозга животных после интракраниальных инъекций векторов разного типа: AAV- DCX-FerrH, LV-DCX-eGFP-T2A-FerrH, LV-CMV-eGFP-T2A-FerrH. Показано, что наиболее эффективная и специфическая экспрессия генов репортеров достигается в результате применения аденоассоциированного вирусного вектора со специфическим промотором даблкортина AAV-DCX-FerrH, а экспрессия, опосредованная лентивирусными конструкциями LV-DCX-eGFP-T2A-FerrH и LV- CMV-eGFP-T2A-FerrH менее специфична, и ее уровень ниже независимо от промотора. Таким образом, с помощью векторных конструкций была получена эффективная и специфическая экспрессия парамагнетика FerrH в тканях головного мозга здоровых животных, накопление которого было успешно визуализировано ex vivo методом МРТ с использованием Т2- и Т2*-взвешенных последовательностей.
ИЛИ
Поиск аналога
📕 Список литературы
🛒 Оформить заказ
⚡ Работу высылаем в течении 5 минут после оплаты.