Подбор условий для получения культуры камбиальных клеток моркови посевной (Daucus sativus Hoffm.)
|
ВВЕДЕНИЕ 3
ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ 6
1 Виды культур растительных клеток и методы их получения (обзор литературы) 6
1.1 Культура дедифферендированных клеток каллуса 8
1.2 Культура недифференцированных камбиальных меристематических клеток 11
1.3 Органные культуры растений 14
1.3.1 Культура побегов 14
1.3.2 Корневая культура 15
1.4 Морковь посевная (Daucus Sativus Hoffm.) как объект исследования 16
2 Материалы и методы 18
2.1 Материалы 18
2.2 Методы 18
2.2.1. Приготовление питательных сред 18
2.2.2 Получение эксплантов и их стерилизация 23
2.2.3 Подбор методов для получения клеток камбиальной меристемы 24
2.2.4 Получение каллусной культуры моркови посевной 25
2.2.5 Микроскопия растительных клеток 25
3 Результаты исследований и их обсуждение 27
3.1 Выбор метода получения эксплантов и стерилизации их поверхности 27
3.2 Подбор условий культивирования эксплантов для получения культур клеток
моркови посевной 28
3.2.1 Получение каллусной культуры клеток моркови 28
3.2.2 Получение камбиальной культуры клеток моркови 29
3.2.3 Изучение морфологических особенностей полученных культур клеток
моркови 31
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 35
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 38
ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ 6
1 Виды культур растительных клеток и методы их получения (обзор литературы) 6
1.1 Культура дедифферендированных клеток каллуса 8
1.2 Культура недифференцированных камбиальных меристематических клеток 11
1.3 Органные культуры растений 14
1.3.1 Культура побегов 14
1.3.2 Корневая культура 15
1.4 Морковь посевная (Daucus Sativus Hoffm.) как объект исследования 16
2 Материалы и методы 18
2.1 Материалы 18
2.2 Методы 18
2.2.1. Приготовление питательных сред 18
2.2.2 Получение эксплантов и их стерилизация 23
2.2.3 Подбор методов для получения клеток камбиальной меристемы 24
2.2.4 Получение каллусной культуры моркови посевной 25
2.2.5 Микроскопия растительных клеток 25
3 Результаты исследований и их обсуждение 27
3.1 Выбор метода получения эксплантов и стерилизации их поверхности 27
3.2 Подбор условий культивирования эксплантов для получения культур клеток
моркови посевной 28
3.2.1 Получение каллусной культуры клеток моркови 28
3.2.2 Получение камбиальной культуры клеток моркови 29
3.2.3 Изучение морфологических особенностей полученных культур клеток
моркови 31
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 35
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 38
Развитие биотехнологии растений привело к созданию технологии культивирования растительных клеток in vitro. На основании знаний о минеральном питании растений были составлены культуральные среды, пригодные для поддержания и размножения растительных клеток (Murashige and Skoog, 1962; Gamborg et al., 1968), что значительно облегчило создание культур клеток растений и обеспечило воспроизводимость условий их культивирования.
Культура клеток высших растений является уникальной биологической системой, позволяющей проанализировать сложность растительного организма на клеточном уровне. Культура растительных клеток широко используется в качестве модельной системы и/или инструмента при проведении исследований в физиологии, биохимии и генетике, а также в биотехнологии растений. Так, было показано, что клеточные культуры растений являются ценным инструментом для анализа сигнальных путей на основе кальция во время взаимодействий между растениями и микробами (Lecourieux et al., 2005; Moscatiello et al., 2006; Navazio et al., 2007). Кроме того, культура клеток растений позволяет изучать механизмы, регулирующие дифференцировку и гибель клеток (Quiroz- Figueroa et al., 2006; Kuczak and Kurczynska, 2020; Cimini et al., 2018), пути метаболизма растений (Wu et al., 2016). Исторически сложилось так, что культуры растений in vitro помогли раскрыть роль некоторых гормонов растений (Caplin and Steward, 1948; Miller et al., 1955; Skoog and Miller, 1957). Это стало одним из важных этапов генной инженерии растений, позволившим создавать растения, наделенные новыми признаками (Duclercq et al., 2011).
Еще одной областью применения культур растительных клеток является крупномасштабное производство вторичных метаболитов и других молекул, представляющих фармацевтический интерес, таких как гетерологичные белки (Krasteva et al., 2020; Marchev et al., 2020; Schillberg et al., 2019).
Культивирование растительных клеток начинается с получения экспланта из любой растительной ткани, но традиционно используются зародыши, корни и побеги. При подходящих условиях культивирования (состав среды, концентрация регуляторов роста растений) эксплант пролиферирует в каллус дедифференцированных клеток (ДДК) (Thorpe, 2012). Для получения суспензионной культуры ткани каллуса переносят в жидкую среду и культивируют при постоянном перемешивании культуры на ротационном или реципрокном шейкере. Эти ДДК считаются тотипотентными из-за их способности регенерировать целое растение.
Процесс дедифференциации клеток сопровождается негативными генетическими модификациями (Baebler et al., 2005), что приводит к снижению скорости роста клеток и нестабильному выходу целевого продукта. Гетерогенность популяции клеток осложняет оптимизацию процесса культивирования. Кроме того, при культивировании суспензии каллусных клеток образуются крупные агрегаты, снижающие выход целевого продукта (Naill and Roberts, 2004).
Важным прорывом в использовании культуры растительных клеток стало выделение камбиальных меристематических клеток (КМК) (Ochoa-Villarreal et al., 2015). КМК были получены из ткани камбия вторичных меристем тиса остроконечного (Taxus cuspidata). Эти клетки ответственны за производство первичных клеток флоэмы и первичной ксилемы в сосудистой сети растений (Lee et al., 2010). КМК характеризовались наличием плотной цитоплазмы, множества мелких вакуолей и тонких клеточных стенок. Эти клетки по своей природе не дифференцированы и функционируют как стволовые клетки растений. Использование суспензионной культуры КМК, позволило обойти недостатки, связанные с применением ДДК, при получении таких ключевых противораковых препаратов как паклитаксел (Taxol) из Taxus cuspidata, (Lee et al., 2010), винбластин и винкристин из Catharanthus roseus (Moon et al., 2015).
Таким образом, получение камбиальных меристематических клеток растений, являющихся источниками активных биологических субстанций, является актуальной задачей биотехнологии растений.
В качестве объекта исследований была выбрана морковь посевная (лат. Daucus sativus Hoffm.), являющаяся подвидом моркови дикой (лат. Daucus carota) семейства зонтичные Apiaceae. Морковь посевная является источником биологически активных веществ, используемых при производстве косметики (Eibl et al., 2018), разработке противоопухолевых препаратов (Liu et al., 2020), рекомбинантных съедобных вакцин (Govea-Alonso et al., 2017).
Цель данной работы - осуществить подбор условий для получения культуры камбиальных клеток моркови посевной D. sativus.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Анализ имеющихся данных в доступной литературе по видам культур растительных клеток и методам их получения.
2. Выбор способа получения эксплантов моркови и их стерилизации .
3. Подбор условий для получения культур клеток моркови посевной.
Практическая значимость. Подбор минеральных питательных веществ и концентрации гормонов для выделения и культивирования камбиальных клеток моркови посевной создаст платформу для получения широкого спектра ценных соединений. Разработанная технология поможет так же в получение камбильных культур других растений.
Работа выполнена на базе лаборатории биотехнологии при кафедре Физиологии растений и биотехнологии Биологического института Национального исследовательского Томского государственного университета.
Культура клеток высших растений является уникальной биологической системой, позволяющей проанализировать сложность растительного организма на клеточном уровне. Культура растительных клеток широко используется в качестве модельной системы и/или инструмента при проведении исследований в физиологии, биохимии и генетике, а также в биотехнологии растений. Так, было показано, что клеточные культуры растений являются ценным инструментом для анализа сигнальных путей на основе кальция во время взаимодействий между растениями и микробами (Lecourieux et al., 2005; Moscatiello et al., 2006; Navazio et al., 2007). Кроме того, культура клеток растений позволяет изучать механизмы, регулирующие дифференцировку и гибель клеток (Quiroz- Figueroa et al., 2006; Kuczak and Kurczynska, 2020; Cimini et al., 2018), пути метаболизма растений (Wu et al., 2016). Исторически сложилось так, что культуры растений in vitro помогли раскрыть роль некоторых гормонов растений (Caplin and Steward, 1948; Miller et al., 1955; Skoog and Miller, 1957). Это стало одним из важных этапов генной инженерии растений, позволившим создавать растения, наделенные новыми признаками (Duclercq et al., 2011).
Еще одной областью применения культур растительных клеток является крупномасштабное производство вторичных метаболитов и других молекул, представляющих фармацевтический интерес, таких как гетерологичные белки (Krasteva et al., 2020; Marchev et al., 2020; Schillberg et al., 2019).
Культивирование растительных клеток начинается с получения экспланта из любой растительной ткани, но традиционно используются зародыши, корни и побеги. При подходящих условиях культивирования (состав среды, концентрация регуляторов роста растений) эксплант пролиферирует в каллус дедифференцированных клеток (ДДК) (Thorpe, 2012). Для получения суспензионной культуры ткани каллуса переносят в жидкую среду и культивируют при постоянном перемешивании культуры на ротационном или реципрокном шейкере. Эти ДДК считаются тотипотентными из-за их способности регенерировать целое растение.
Процесс дедифференциации клеток сопровождается негативными генетическими модификациями (Baebler et al., 2005), что приводит к снижению скорости роста клеток и нестабильному выходу целевого продукта. Гетерогенность популяции клеток осложняет оптимизацию процесса культивирования. Кроме того, при культивировании суспензии каллусных клеток образуются крупные агрегаты, снижающие выход целевого продукта (Naill and Roberts, 2004).
Важным прорывом в использовании культуры растительных клеток стало выделение камбиальных меристематических клеток (КМК) (Ochoa-Villarreal et al., 2015). КМК были получены из ткани камбия вторичных меристем тиса остроконечного (Taxus cuspidata). Эти клетки ответственны за производство первичных клеток флоэмы и первичной ксилемы в сосудистой сети растений (Lee et al., 2010). КМК характеризовались наличием плотной цитоплазмы, множества мелких вакуолей и тонких клеточных стенок. Эти клетки по своей природе не дифференцированы и функционируют как стволовые клетки растений. Использование суспензионной культуры КМК, позволило обойти недостатки, связанные с применением ДДК, при получении таких ключевых противораковых препаратов как паклитаксел (Taxol) из Taxus cuspidata, (Lee et al., 2010), винбластин и винкристин из Catharanthus roseus (Moon et al., 2015).
Таким образом, получение камбиальных меристематических клеток растений, являющихся источниками активных биологических субстанций, является актуальной задачей биотехнологии растений.
В качестве объекта исследований была выбрана морковь посевная (лат. Daucus sativus Hoffm.), являющаяся подвидом моркови дикой (лат. Daucus carota) семейства зонтичные Apiaceae. Морковь посевная является источником биологически активных веществ, используемых при производстве косметики (Eibl et al., 2018), разработке противоопухолевых препаратов (Liu et al., 2020), рекомбинантных съедобных вакцин (Govea-Alonso et al., 2017).
Цель данной работы - осуществить подбор условий для получения культуры камбиальных клеток моркови посевной D. sativus.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Анализ имеющихся данных в доступной литературе по видам культур растительных клеток и методам их получения.
2. Выбор способа получения эксплантов моркови и их стерилизации .
3. Подбор условий для получения культур клеток моркови посевной.
Практическая значимость. Подбор минеральных питательных веществ и концентрации гормонов для выделения и культивирования камбиальных клеток моркови посевной создаст платформу для получения широкого спектра ценных соединений. Разработанная технология поможет так же в получение камбильных культур других растений.
Работа выполнена на базе лаборатории биотехнологии при кафедре Физиологии растений и биотехнологии Биологического института Национального исследовательского Томского государственного университета.
Подводя итог проделанной работы, можно сказать, что культивирование клеток растений in vitro является уникальным и ценным биологическим инструментом для изучения физиологии растений, биохимии, генетики, а также биотехнологии растений. Культура клеток и тканей растений нашла широкое применение в производстве вторичных метаболитов растений, а также гетерогенных белков, востребованных в фармакологии, пищевой, парфюмерной, химической промышленности. С этой целью используют органные и суспензионные, полученные на основе дедифференцированных клеток, культуры.
Дедифференцированные, или каллусные клетки характеризуются генетической нестабильностью, неоднородностью, что зачастую затрудняет их использование. Перспективной альтернативой дедифференцированным каллусным клеткам стали так называемые стволовые изначально недифференцированные клетки растений, полученные из первичных меристем. Теоретически эти клетки генетически стабильны и могут делиться неограниченное число раз. Культура камбиальных клеток может послужить экономически выгодным, экологически чистым и устойчивым источником важных природных продуктов.
В качестве объекта исследования была выбрана морковь посевная (Daucus sativus Hoffm) подвид моркови дикой (Daucus cardia L), которая широко используется в биотехнологии растений. Органные и каллусные культуры клеток моркови используют для производства биологически активных веществ. В данных исследованиях морковь была использована для получения камбиальной культуры клеток. Были подобраны способы получения, стерилизации эксплантов растительной ткани. Установлено, что для получения эксплантов оптимально использовать здоровые корнеплоды. Экспланты должны содержать участок камбиального кольца. Для стерилизации поверхности экспланты необходимо выдержать в растворе 0,01% сулемы в течение 5-8 мин. Это позволяет дезинфицировать поверхность экспланта не оказывая существенного влияния на жизнеспособность клеток.
Получение каллусной культуры не требовало какой-либо обработки растительных эксплантов. Каллусы формировались, начиная с 6 недели инкубирования, на питательной среде MS с добавлением фитогормонов. Установлено, что для получения камбиальных клеток эксплант необходимо подвергнуть осмотическому стрессу сахарозой в течение 2 час. Это приводило к торможению роста и деления клеток, а в случае более длительного воздействия и гибели эксплантов. После снятия осмотического стресса экспланты следует культивировать на среде, индуцирующей рост камбиальных клеток. В ее состав входит минеральная основа WPM с органическими добавками по MS. Через 3-4 недели в зоне камбиального кольца отмечено интенсивный рост и деление клеток. Морфологически образовавшиеся агрегаты клеток отличаются от каллусных тканей своей однородностью и
гомогенностью.
При проведение микроскопирования было показано что, в результате экспериментального исследования клетки, имеют большие размеры по сравнению с клетками контроля. Клетки так же имеют овальную и круглые формы, в отличие от клеток контроля, которые имеют овальные, трапециевидные, пентагональную формы. У клеток экспериментального исследования так же имеется множество мелких вакуолей, что характерно для клеток камбиальной меристемы и у образца контроля
Подбор условий получения камбиальных клеток моркови создает основу для проведения дальнейших исследований по изучению физиологии и биохимии камбиальных клеток, поиск генетических маркеров для быстрой идентификации и стандартизации данного типа клеток, а также их использованию для выделения биологически активных веществ.
В заключение можно сказать что:
1. Проведен анализ источников литературы по теме выпускной квалификационной работе бакалавра для обоснования теоретических предположений, положенных в основу сформулированной цели исследования.
2. Показано, что достаточным условием для стерилизации поверхности экспланта без значимого влияния на жизнеспособность клеток является обработка экспланта 0,01% раствором сулемы в течение 5-8 мин.
3. Выявлено, что необходимым условием получения камбиальных клеток моркови является предварительное воздействие на эксплант осмотического стресса сахарозой в течение 2 час. Использование культуральной среды на минеральной основе WPM с органическими добавками по MS позволяет получить интенсивный рост и деление клеток камбиального кольца через 3-4 недели от начала культивирования.
4. Показано, что полученные клетки моркови значительно отличаются от клеток контроля
большим размером и выраженной овальной формой, в то время как более мелкие клетки контроля имеют овальные, трапециевидные, пентагональные формы. У клеток,
полученных из камбиального кольца моркови, так же имеется множество мелких вакуолей, что характерно для клеток камбиальной меристемы.
Результаты работы были представлены на LXX научной студенческой конференции Биологического института «Старт в науку», Томск, 2021 г.
Фокина Е.В., Филонова М.В. Подбор условий для получения культуры камбиальных клеток моркови посевной (Daucus sativus Hoffm.): Материалы LXX научной студенческой конференции Биологического института «Старт в науку». Томск, 26-30 апреля 2021 г. - Томск, 2021 - С. 51.
Дедифференцированные, или каллусные клетки характеризуются генетической нестабильностью, неоднородностью, что зачастую затрудняет их использование. Перспективной альтернативой дедифференцированным каллусным клеткам стали так называемые стволовые изначально недифференцированные клетки растений, полученные из первичных меристем. Теоретически эти клетки генетически стабильны и могут делиться неограниченное число раз. Культура камбиальных клеток может послужить экономически выгодным, экологически чистым и устойчивым источником важных природных продуктов.
В качестве объекта исследования была выбрана морковь посевная (Daucus sativus Hoffm) подвид моркови дикой (Daucus cardia L), которая широко используется в биотехнологии растений. Органные и каллусные культуры клеток моркови используют для производства биологически активных веществ. В данных исследованиях морковь была использована для получения камбиальной культуры клеток. Были подобраны способы получения, стерилизации эксплантов растительной ткани. Установлено, что для получения эксплантов оптимально использовать здоровые корнеплоды. Экспланты должны содержать участок камбиального кольца. Для стерилизации поверхности экспланты необходимо выдержать в растворе 0,01% сулемы в течение 5-8 мин. Это позволяет дезинфицировать поверхность экспланта не оказывая существенного влияния на жизнеспособность клеток.
Получение каллусной культуры не требовало какой-либо обработки растительных эксплантов. Каллусы формировались, начиная с 6 недели инкубирования, на питательной среде MS с добавлением фитогормонов. Установлено, что для получения камбиальных клеток эксплант необходимо подвергнуть осмотическому стрессу сахарозой в течение 2 час. Это приводило к торможению роста и деления клеток, а в случае более длительного воздействия и гибели эксплантов. После снятия осмотического стресса экспланты следует культивировать на среде, индуцирующей рост камбиальных клеток. В ее состав входит минеральная основа WPM с органическими добавками по MS. Через 3-4 недели в зоне камбиального кольца отмечено интенсивный рост и деление клеток. Морфологически образовавшиеся агрегаты клеток отличаются от каллусных тканей своей однородностью и
гомогенностью.
При проведение микроскопирования было показано что, в результате экспериментального исследования клетки, имеют большие размеры по сравнению с клетками контроля. Клетки так же имеют овальную и круглые формы, в отличие от клеток контроля, которые имеют овальные, трапециевидные, пентагональную формы. У клеток экспериментального исследования так же имеется множество мелких вакуолей, что характерно для клеток камбиальной меристемы и у образца контроля
Подбор условий получения камбиальных клеток моркови создает основу для проведения дальнейших исследований по изучению физиологии и биохимии камбиальных клеток, поиск генетических маркеров для быстрой идентификации и стандартизации данного типа клеток, а также их использованию для выделения биологически активных веществ.
В заключение можно сказать что:
1. Проведен анализ источников литературы по теме выпускной квалификационной работе бакалавра для обоснования теоретических предположений, положенных в основу сформулированной цели исследования.
2. Показано, что достаточным условием для стерилизации поверхности экспланта без значимого влияния на жизнеспособность клеток является обработка экспланта 0,01% раствором сулемы в течение 5-8 мин.
3. Выявлено, что необходимым условием получения камбиальных клеток моркови является предварительное воздействие на эксплант осмотического стресса сахарозой в течение 2 час. Использование культуральной среды на минеральной основе WPM с органическими добавками по MS позволяет получить интенсивный рост и деление клеток камбиального кольца через 3-4 недели от начала культивирования.
4. Показано, что полученные клетки моркови значительно отличаются от клеток контроля
большим размером и выраженной овальной формой, в то время как более мелкие клетки контроля имеют овальные, трапециевидные, пентагональные формы. У клеток,
полученных из камбиального кольца моркови, так же имеется множество мелких вакуолей, что характерно для клеток камбиальной меристемы.
Результаты работы были представлены на LXX научной студенческой конференции Биологического института «Старт в науку», Томск, 2021 г.
Фокина Е.В., Филонова М.В. Подбор условий для получения культуры камбиальных клеток моркови посевной (Daucus sativus Hoffm.): Материалы LXX научной студенческой конференции Биологического института «Старт в науку». Томск, 26-30 апреля 2021 г. - Томск, 2021 - С. 51.
