Влияние наивных и репрограммированных CD8+ Т-лимфоцитов на капилляры легочной ткани при экспериментальной карциноме легких
|
СПИСОК СОКРАЩЕНИЯ 6
ВВЕДЕНИЕ 7
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
1.1 Этиология и эпидемиология рака легких 10
1.2 Патогенез механизмы развития рака легких 13
1.3 Микроокружение опухоли 16
1.4 Ангиогенез при раке легких 17
1.5 Влияние Т-лимфоцитов на ангиогенез 22
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 24
2.1 Клеточная линия 24
2.2 Объект исследования 24
2.3 Ортотопическая модель 24
2.4 Модель спонтанного метастазирования 24
2.5 Репрограммирование Т-лимфоцитов 25
2.6 Выделение мононуклеаров из селезенки 27
2.7 Выделение мононуклеаров из костного мозга 28
2.8 Получение культуры эндотелиальных клеток лёгких 28
2.9 Экспериментальные группы 29
2.10 Получение и исследование гистологических препаратов из легочной ткани 30
2.11 Окрашивание гистологических препаратов из легочной ткани 30
2.12 Оценка плотности капилляров в легочной ткани 30
2.13 Статистическая обработка данных 31
3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ 32
3.1 Гистологическое исследование легкого 32
3.2 Морфометрическое исследование плотности синусоидных капилляров в легочной ткани 33
3.3 Оценка пролиферации эндотелия в клеточной культуре 37
ВЫВОДЫ 42
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАНОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 43
ВВЕДЕНИЕ 7
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
1.1 Этиология и эпидемиология рака легких 10
1.2 Патогенез механизмы развития рака легких 13
1.3 Микроокружение опухоли 16
1.4 Ангиогенез при раке легких 17
1.5 Влияние Т-лимфоцитов на ангиогенез 22
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 24
2.1 Клеточная линия 24
2.2 Объект исследования 24
2.3 Ортотопическая модель 24
2.4 Модель спонтанного метастазирования 24
2.5 Репрограммирование Т-лимфоцитов 25
2.6 Выделение мононуклеаров из селезенки 27
2.7 Выделение мононуклеаров из костного мозга 28
2.8 Получение культуры эндотелиальных клеток лёгких 28
2.9 Экспериментальные группы 29
2.10 Получение и исследование гистологических препаратов из легочной ткани 30
2.11 Окрашивание гистологических препаратов из легочной ткани 30
2.12 Оценка плотности капилляров в легочной ткани 30
2.13 Статистическая обработка данных 31
3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ 32
3.1 Гистологическое исследование легкого 32
3.2 Морфометрическое исследование плотности синусоидных капилляров в легочной ткани 33
3.3 Оценка пролиферации эндотелия в клеточной культуре 37
ВЫВОДЫ 42
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАНОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 43
В последнее время рак легкого находится на втором месте по заболеваемости и на первом по смертности. Рак легкого является редким примером злокачественного заболевания с твердо установленными и очерченными этиологическими факторами. В большинстве случаев возникновение рака легкого принято связать с курением; кроме того, РЛ может быть связан с другими канцерогенными агентами, находящимися во вдыхаемом воздухе, - пылью асбеста, выхлопными газами и т. д. Тем не менее если бы взаимосвязь между курением и возникновением рака легкого была безусловной, то вряд ли оставалось бы популярной привычкой. Действительно, ни сигаретный дым, ни другие внешние воздействия не являются абсолютными факторами риска в масштабе человеческих популяций. Чувствительность к РЛ-ассоциированным веществам значительно варьирует от индивидуума к индивидууму и, по-видимому, опосредуется за счет генетических факторов [Шуткин и др., 2017].
Для поддержания роста опухоли требуется постоянная доставка питательных веществ и кислорода. Для этого, а также для осуществления метастазирования опухолевых клеток необходима хорошо развитая сосудистая сеть, которая формируется за счет развития существующих сосудов, образования новых (ангиогенеза) и/или рекрутирования (привлечения) эндотелиальных клеток костного мозга (постнатальный ангиогенез). В результате образуется сосудистая сеть опухоли, которая оказывается неполноценной как в структурном, так и в функциональном отношении. Сосуды легко проницаемы, извиты, расширены и часто сообщаются между собой случайными шунтами. Выстилающие их эндотелиальные клетки морфологически повреждены, перициты (клетки, поддерживающие эндотелий) разрыхлены или отсутствуют, базальная мембрана - обычно утолщена, а иногда отсутствует. В связи с такими нарушениями кровоток в опухоли становится дезорганизованным и неравномерными. Кроме того, активно пролиферирующие опухолевые клетки дополнительно оказывают давление на кровеносные и лимфатические сосуды [Ярмоненко, 2005].
Одной из функций иммунной системы является препятствование развитию и прогрессированию рака, в том числе метастатической болезни [Janssen et al., 2017 ; Gonzalez et al., 2018]. Такие клетки иммунной системы как Т-лимфоциты выступают важным звеном противоопухолевого иммунитета. Так, CD8+ Т-лимфоциты вызывают гибель опухолевых клеток путем секреции цитотоксических молекул (перфорин, гранзимы). Интерферон-у, секретируемый CD8+ Т-лимфоцитами, усиливает противоопухолевые свойства других иммунных клеток [Tsukumo et al., 2018]. Клональной экспансии, дифференцировке и активации цитотоксических CD8+ Т-лимфоцитов способствуют CD4+ Т-лимфоциты [Li et al., 2020 ; Tay et al., 2021]. Эти свойства CD8+ Т-клеток открывают определённые перспективы для разработки подходов лечения рака на их основе.
Т-клетки человека являются центральными эффекторами иммунитета и иммунотерапии рака. Существует несколько методов репрограммирования Т- лимофоцитов: генетическое репрограммирования - новый метод лентивируснной трансфекции с одной направляющей РНК с электропорацией белка Cas9 (SLICE), для идентификации регуляторов стимуляции ответов в первичных Т-клетках [Shifrut et al., 2018]; метаболическое репрограммирование путем усиления митохондриального окислительного фосфорилирования, зависящего от носителя пирувата [Guo et al., 2021].
Метаболическое репрограммирование не ведет за собой изменения клеточной идентичности [Zimmermannova et al., 2021]. Так, Guo H. et al. показали, что восстановление цитотоксической функции и пролиферативной активности истощенных CD8+ Т- лимфоцитов может происходить под влиянием ИЛ-10 [Guo et al., 2021]. Verma et al. продемонстрировали, что ингибирование сигнального пути МАРК / ERK приводит к усилению противоопухолевой активности за счет метаболического репрограммирования эффекторных CD8+ Т-лимфоцитов [Verma et al., 2021]. Показано, что механизм действия ингибиторов MEK1/2 основан на усилении метаболической приспособляемости Т-клеток за счет модулирования метаболического пути ERK1/2 -циклин D1 - PGC1a-SIRT3 - FAO. Активация Т-клеточных рецепторов подготавливает клетку к делению, однако временное ингибирование MEK1/2 снижает уровни активированного ERK1/2 и циклина D1, что вызывает задержку клеточного цикла и увеличивает PGC1a / SIRT3 с последующим усилением метаболизма за счет увеличения окисления жирных кислот, но при этом, не оказывая влияния на активацию Т-клеток, опосредованную антигеном. В результате чего генерируется популяция Т-клеток памяти, подобных стволовым (Tscm). Tscm являются клетками, которые филогенетически находятся между популяцией наивных Т-клеток и популяцией Т-клеток памяти. Эти клетки отличают от клеток центральной памяти (Tcm) более высокое метилирование эффекторных генов, самообновляемость, мультипотентность и способность к пролиферации. MEKi-индуцированные Tscm клетки демонстрируют сильную клеточную активацию, высокие антиген-специфические отклики и длительную выживаемость [Gattinoni et al., 2017].
Цель: исследование воздействия наивных и метаболически репрограммированных CD8+ Т-лимфоцитов, полученных из селезенки и костного мозга, на эндотелиальные клетки и плотность капилляров в легочной ткани на моделях спонтанного метастазирования и ортотопической трансплантации карциномы легких Льюис.
Задачи:
1. Сравнить воздействие трансплантации клеток карциномы легких Льюис на плотность капилляров в легочной ткани на модели спонтанного метастазирования и ортотопической модели.
2. Исследовать воздействие наивных и метаболически репрограммированных CD8+ Т- лимфоцитов на плотность капилляров в легочной ткани на модели спонтанного метастазирования и ортотопической модели карциномы легких Льюис.
3. Исследовать воздействие наивных и метаболически репрограммированных CD8+ Т- лимфоцитов на эндотелиальные клетки легких на модели спонтанного метастазирования и ортотопической модели карциномы легких Льюис.
Работа была выполнена на материально-технической базе НИИФиРМ имени Е.Д. Гольдберга Томского НИМЦ РАН. Под руководством кандидата биологических наук, научного сотрудника лаборатории регенеративной медицины Э. С. Пан и кандидата биологических наук, доцента и заведующего кафедры «Физиология человека и животных» Биологического института НИ ТГУ М. В. Светлик.
Для поддержания роста опухоли требуется постоянная доставка питательных веществ и кислорода. Для этого, а также для осуществления метастазирования опухолевых клеток необходима хорошо развитая сосудистая сеть, которая формируется за счет развития существующих сосудов, образования новых (ангиогенеза) и/или рекрутирования (привлечения) эндотелиальных клеток костного мозга (постнатальный ангиогенез). В результате образуется сосудистая сеть опухоли, которая оказывается неполноценной как в структурном, так и в функциональном отношении. Сосуды легко проницаемы, извиты, расширены и часто сообщаются между собой случайными шунтами. Выстилающие их эндотелиальные клетки морфологически повреждены, перициты (клетки, поддерживающие эндотелий) разрыхлены или отсутствуют, базальная мембрана - обычно утолщена, а иногда отсутствует. В связи с такими нарушениями кровоток в опухоли становится дезорганизованным и неравномерными. Кроме того, активно пролиферирующие опухолевые клетки дополнительно оказывают давление на кровеносные и лимфатические сосуды [Ярмоненко, 2005].
Одной из функций иммунной системы является препятствование развитию и прогрессированию рака, в том числе метастатической болезни [Janssen et al., 2017 ; Gonzalez et al., 2018]. Такие клетки иммунной системы как Т-лимфоциты выступают важным звеном противоопухолевого иммунитета. Так, CD8+ Т-лимфоциты вызывают гибель опухолевых клеток путем секреции цитотоксических молекул (перфорин, гранзимы). Интерферон-у, секретируемый CD8+ Т-лимфоцитами, усиливает противоопухолевые свойства других иммунных клеток [Tsukumo et al., 2018]. Клональной экспансии, дифференцировке и активации цитотоксических CD8+ Т-лимфоцитов способствуют CD4+ Т-лимфоциты [Li et al., 2020 ; Tay et al., 2021]. Эти свойства CD8+ Т-клеток открывают определённые перспективы для разработки подходов лечения рака на их основе.
Т-клетки человека являются центральными эффекторами иммунитета и иммунотерапии рака. Существует несколько методов репрограммирования Т- лимофоцитов: генетическое репрограммирования - новый метод лентивируснной трансфекции с одной направляющей РНК с электропорацией белка Cas9 (SLICE), для идентификации регуляторов стимуляции ответов в первичных Т-клетках [Shifrut et al., 2018]; метаболическое репрограммирование путем усиления митохондриального окислительного фосфорилирования, зависящего от носителя пирувата [Guo et al., 2021].
Метаболическое репрограммирование не ведет за собой изменения клеточной идентичности [Zimmermannova et al., 2021]. Так, Guo H. et al. показали, что восстановление цитотоксической функции и пролиферативной активности истощенных CD8+ Т- лимфоцитов может происходить под влиянием ИЛ-10 [Guo et al., 2021]. Verma et al. продемонстрировали, что ингибирование сигнального пути МАРК / ERK приводит к усилению противоопухолевой активности за счет метаболического репрограммирования эффекторных CD8+ Т-лимфоцитов [Verma et al., 2021]. Показано, что механизм действия ингибиторов MEK1/2 основан на усилении метаболической приспособляемости Т-клеток за счет модулирования метаболического пути ERK1/2 -циклин D1 - PGC1a-SIRT3 - FAO. Активация Т-клеточных рецепторов подготавливает клетку к делению, однако временное ингибирование MEK1/2 снижает уровни активированного ERK1/2 и циклина D1, что вызывает задержку клеточного цикла и увеличивает PGC1a / SIRT3 с последующим усилением метаболизма за счет увеличения окисления жирных кислот, но при этом, не оказывая влияния на активацию Т-клеток, опосредованную антигеном. В результате чего генерируется популяция Т-клеток памяти, подобных стволовым (Tscm). Tscm являются клетками, которые филогенетически находятся между популяцией наивных Т-клеток и популяцией Т-клеток памяти. Эти клетки отличают от клеток центральной памяти (Tcm) более высокое метилирование эффекторных генов, самообновляемость, мультипотентность и способность к пролиферации. MEKi-индуцированные Tscm клетки демонстрируют сильную клеточную активацию, высокие антиген-специфические отклики и длительную выживаемость [Gattinoni et al., 2017].
Цель: исследование воздействия наивных и метаболически репрограммированных CD8+ Т-лимфоцитов, полученных из селезенки и костного мозга, на эндотелиальные клетки и плотность капилляров в легочной ткани на моделях спонтанного метастазирования и ортотопической трансплантации карциномы легких Льюис.
Задачи:
1. Сравнить воздействие трансплантации клеток карциномы легких Льюис на плотность капилляров в легочной ткани на модели спонтанного метастазирования и ортотопической модели.
2. Исследовать воздействие наивных и метаболически репрограммированных CD8+ Т- лимфоцитов на плотность капилляров в легочной ткани на модели спонтанного метастазирования и ортотопической модели карциномы легких Льюис.
3. Исследовать воздействие наивных и метаболически репрограммированных CD8+ Т- лимфоцитов на эндотелиальные клетки легких на модели спонтанного метастазирования и ортотопической модели карциномы легких Льюис.
Работа была выполнена на материально-технической базе НИИФиРМ имени Е.Д. Гольдберга Томского НИМЦ РАН. Под руководством кандидата биологических наук, научного сотрудника лаборатории регенеративной медицины Э. С. Пан и кандидата биологических наук, доцента и заведующего кафедры «Физиология человека и животных» Биологического института НИ ТГУ М. В. Светлик.
Одной из функций иммунной системы является препятствование развитию и прогрессированию рака, в том числе метастатической болезни [Jansse et al., 2017; Gonzalez et al., 2018]. Такие клетки иммунной системы как Т-лимфоциты выступают важным звеном противоопухолевого иммунитета. Интерферон-у, секретируемый CD8+ Т-лимфоцитами, усиливает противоопухолевые свойства других иммунных клеток [Tsukumo et al., 2018]. Клональной экспансии, дифференцировке и активации цитотоксических CD8+ Т- лимфоцитов способствуют CD4+ Т-лимфоциты [Li et al., 2020 ; Tay et al., 2021]. Эти свойства CD8+ Т-клеток открывают определённые перспективы для разработки подходов лечения рака на их основе.
Т-лимфоциты также способны синтезировать VEGF и участвовать в регуляции ангиогенеза, хотя, по-видимому, в меньшей степени, чем макрофаги. Следует отметить, что взаимодействие процессов ангиогенеза со специфическим иммунным ответом не изучено, однако показана способность Т-лимфоцитов человека и животных синтезировать VEGF. Индуктором синтеза VEGF в Т-лимфоцитах, как и в макрофагах, служит гипоксия. Синтез VEGF в Т-лимфоцитах также усиливается при их активации форболовым эфиром, анти- CDS антителами, IL-2 или конканавалином А in vitro. Синтез и продукция VEGF периферическими Т-лимфоцитами может повышаться при патологических состояниях, например, у больных туберкулезом или в условиях опухолевого роста у людей и животных. Иммуногистохимическим окрашиванием было показано, что Т-лимфоциты, инфильтрующие карциному мочевыводящих путей человека, синтезируют VEGF [Киселева и др., 2009].
В экспериментальных условиях было показано, что CD4+ и CD8+ Т-лимфоциты инфильтрируют ишемизированные ткани, где способствуют развитию коллатеральных сосудов. При развитии церебральной ишемии CD8+ Т-лимфоциты инфильтрируют периваскулярные пространства и синтезируют IL-16, который является хемоаттрактантом для CD4+ мононуклеаров [Киселева и др., 2009].
Недавно был охарактеризован фенотип CD3+ CD31+ CXCR4+ ангиогенных Т-клеток, способных к активному синтезу VEGF, IL-8 и матриксных металлопротеиназ. Показано, что эти клетки располагаются в центре колоний, образованных ранними эндотелиальными предшественниками, полученными из периферической крови животных. Ангиогенные Т- лимфоциты усиливали пролиферацию, способность к формированию трубок в геле и адгезию эндотелиальных клеток. Киселева Е. П. и др. считают, что специфическим маркером ангиогенных Т-лимфоцитов является CD31 - адгезионная молекула PECAM-1.
Экспрессия на их поверхности CXCR4 - рецептора стромального фактора SDF-1 - определяет их способность рекрутироваться в зоны ишемии, где уровень экспрессии этого фактора достаточно высокий [Киселева и др., 2009].
Не только зрелые Т-лимфоциты, но и их предшественники способны синтезировать VEGF. Ранее был обнаружен синтез матричного РНК и белка VEGF в цельном тимусе мышей. Недавно показали, что как тимоциты, так и строма тимуса мышей могут конститутивно экспрессировать матричное РНК VEGF [Киселева и др., 2009].
Влияние Т-клеток на микрососудистое русло происходит за счет разных механизмов. При острой воспалительной реакции в легких повреждение, обусловленное цитотоксическими CD8+ Т-клетками, и повышение проницаемости эндотелиальных клеток капилляров приводит к утечке жидкости в легочную паренхиму [Омаров и др., 2021].
IP-10 является членом семейства хемокинов CXC, индуцирует хемотаксис активированных Т-клетки, регулируют пролиферацию перицитов капиллярной стенки, и ингибируют ангиогенез. Подавление продукции IP-10 в эксперименте приводит к регрессу опухолевого роста меланомы, лимфомы, НМРЛ [Каюкова и др., 2020].
MIP-1a мощный активатор как врожденных, так и адаптивных реакций. CCL3 играет критическую роль в рекрутировании различных иммунных клеток в опухолевый очаг, индуцирует антиген-специфические Т-клеточные ответы, ангиогенез, усиливает миграцию опухолевых клеток [Каюкова и др., 2020].
Т-лимфоциты также способны синтезировать VEGF и участвовать в регуляции ангиогенеза, хотя, по-видимому, в меньшей степени, чем макрофаги. Следует отметить, что взаимодействие процессов ангиогенеза со специфическим иммунным ответом не изучено, однако показана способность Т-лимфоцитов человека и животных синтезировать VEGF. Индуктором синтеза VEGF в Т-лимфоцитах, как и в макрофагах, служит гипоксия. Синтез VEGF в Т-лимфоцитах также усиливается при их активации форболовым эфиром, анти- CDS антителами, IL-2 или конканавалином А in vitro. Синтез и продукция VEGF периферическими Т-лимфоцитами может повышаться при патологических состояниях, например, у больных туберкулезом или в условиях опухолевого роста у людей и животных. Иммуногистохимическим окрашиванием было показано, что Т-лимфоциты, инфильтрующие карциному мочевыводящих путей человека, синтезируют VEGF [Киселева и др., 2009].
В экспериментальных условиях было показано, что CD4+ и CD8+ Т-лимфоциты инфильтрируют ишемизированные ткани, где способствуют развитию коллатеральных сосудов. При развитии церебральной ишемии CD8+ Т-лимфоциты инфильтрируют периваскулярные пространства и синтезируют IL-16, который является хемоаттрактантом для CD4+ мононуклеаров [Киселева и др., 2009].
Недавно был охарактеризован фенотип CD3+ CD31+ CXCR4+ ангиогенных Т-клеток, способных к активному синтезу VEGF, IL-8 и матриксных металлопротеиназ. Показано, что эти клетки располагаются в центре колоний, образованных ранними эндотелиальными предшественниками, полученными из периферической крови животных. Ангиогенные Т- лимфоциты усиливали пролиферацию, способность к формированию трубок в геле и адгезию эндотелиальных клеток. Киселева Е. П. и др. считают, что специфическим маркером ангиогенных Т-лимфоцитов является CD31 - адгезионная молекула PECAM-1.
Экспрессия на их поверхности CXCR4 - рецептора стромального фактора SDF-1 - определяет их способность рекрутироваться в зоны ишемии, где уровень экспрессии этого фактора достаточно высокий [Киселева и др., 2009].
Не только зрелые Т-лимфоциты, но и их предшественники способны синтезировать VEGF. Ранее был обнаружен синтез матричного РНК и белка VEGF в цельном тимусе мышей. Недавно показали, что как тимоциты, так и строма тимуса мышей могут конститутивно экспрессировать матричное РНК VEGF [Киселева и др., 2009].
Влияние Т-клеток на микрососудистое русло происходит за счет разных механизмов. При острой воспалительной реакции в легких повреждение, обусловленное цитотоксическими CD8+ Т-клетками, и повышение проницаемости эндотелиальных клеток капилляров приводит к утечке жидкости в легочную паренхиму [Омаров и др., 2021].
IP-10 является членом семейства хемокинов CXC, индуцирует хемотаксис активированных Т-клетки, регулируют пролиферацию перицитов капиллярной стенки, и ингибируют ангиогенез. Подавление продукции IP-10 в эксперименте приводит к регрессу опухолевого роста меланомы, лимфомы, НМРЛ [Каюкова и др., 2020].
MIP-1a мощный активатор как врожденных, так и адаптивных реакций. CCL3 играет критическую роль в рекрутировании различных иммунных клеток в опухолевый очаг, индуцирует антиген-специфические Т-клеточные ответы, ангиогенез, усиливает миграцию опухолевых клеток [Каюкова и др., 2020].
