ЭКСПРЕССИОННЫЙ ПРОФИЛЬ РАЗЛИЧНЫХ ПРЕДОПУХОЛЕВЫХ ИЗМЕНЕНИЙ ЭПИТЕЛИЯ БРОНХОВ
|
Аннотация
ВВЕДЕНИЕ 6
ГЛАВА 1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 9
1.1 Рак легкого 9
1.1.1 Классификация РЛ 9
1.1.2 Этиология РЛ 11
1.1.3 Молекулярно-генетический патогенез РЛ 12
1.2 Предопухолевые изменения бронхиального эпителия 16
1.2.1 Морфологические характеристики предопухолевых изменений
эпителия бронхов 17
1.2.2 Генетические изменения в эпителии бронхов в ходе
предопухолевого процесса 21
1.2.3 Эпигенетические изменения в эпителии бронхов в ходе
предопухолевого процесса 22
1.2.4 Особенности транскриптома и протеома предопухолевых
изменений эпителия бронхов 24
ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 28
2.1 Материалы исследования 28
2.2 Методы исследования 29
2.2.1 Лазерная микродиссекция 29
2.2.2 Выделение РНК и полнотранскриптомная амплификация 29
2.2.3 Микроматричный экспрессионный анализ 30
2.2.4 Иммуногистохимическое окрашивание 30
2.2.5 Биоинформатический анализ и статистическая обработка данных
33
ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 35
3.1 Экспрессионный профиль различных вариантов морфологических изменений эпителия бронхов 35
3.1.1 Экспрессионный профиль иБКГ 37
3
3.1.2 Экспрессионный профиль пмБКГ 39
3.1.3 Экспрессионный профиль бкгПМ 40
3.1.4 Экспрессионный профиль дПМ 42
3.1.5 Экспрессионный профиль дисплазии 44
3.2 Валидация экспрессии генов, специфических для различных предопухолевых изменений эпителия бронхов 48
ВЫВОДЫ 51
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 52
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 54
ВВЕДЕНИЕ 6
ГЛАВА 1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 9
1.1 Рак легкого 9
1.1.1 Классификация РЛ 9
1.1.2 Этиология РЛ 11
1.1.3 Молекулярно-генетический патогенез РЛ 12
1.2 Предопухолевые изменения бронхиального эпителия 16
1.2.1 Морфологические характеристики предопухолевых изменений
эпителия бронхов 17
1.2.2 Генетические изменения в эпителии бронхов в ходе
предопухолевого процесса 21
1.2.3 Эпигенетические изменения в эпителии бронхов в ходе
предопухолевого процесса 22
1.2.4 Особенности транскриптома и протеома предопухолевых
изменений эпителия бронхов 24
ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 28
2.1 Материалы исследования 28
2.2 Методы исследования 29
2.2.1 Лазерная микродиссекция 29
2.2.2 Выделение РНК и полнотранскриптомная амплификация 29
2.2.3 Микроматричный экспрессионный анализ 30
2.2.4 Иммуногистохимическое окрашивание 30
2.2.5 Биоинформатический анализ и статистическая обработка данных
33
ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 35
3.1 Экспрессионный профиль различных вариантов морфологических изменений эпителия бронхов 35
3.1.1 Экспрессионный профиль иБКГ 37
3
3.1.2 Экспрессионный профиль пмБКГ 39
3.1.3 Экспрессионный профиль бкгПМ 40
3.1.4 Экспрессионный профиль дПМ 42
3.1.5 Экспрессионный профиль дисплазии 44
3.2 Валидация экспрессии генов, специфических для различных предопухолевых изменений эпителия бронхов 48
ВЫВОДЫ 51
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 52
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 54
Рак легкого (РЛ) прочно занимает лидирующую позицию в структуре онкологической заболеваемости и смертности во всем мире (Cheng et al. 2016). Как правило, РЛ выявляется на поздней стадии ввиду несовершенной системы ранней диагностики и быстрого роста и прогрессии данного заболевания. Всё это обуславливает высокую актуальность проведения исследований, направленных на поиск высокоэффективных маркеров раннего обнаружения РЛ и терапевтических мишеней с целью предотвращения развития данного новообразования. В этом аспекте представляется актуальным смещение исследовательского акцента на предопухолевый процесс в бронхиальном эпителии.
Канцерогенез в лёгком представляет собой сложный многоступенчатый процесс последовательного накопления генетических и молекулярных нарушений, идущего параллельно с морфологическими изменениями от нормального эпителия через базальноклеточную гиперплазию (БКГ), плоскоклеточную метаплазию (ПМ), дисплазии (I-III степени) к карциноме in situ (CIS) и инвазивному раку (Kadara et al.,2014; Панкова и др., 2014). Предопухолевый процесс может быть как последовательным (как описано выше), так и прерывистым, когда возможна остановка процесса на любом из морфологических изменений бронхиального эпителия. Доказательством этого свидетельствует тот факт, что вышеперечисленные морфологические изменения могут встречаться в бронхиальном эпителии больных немелкоклеточным раком легкого (НМРЛ) (Kadara et al., 2016). Более того, морфологические изменения эпителия могут находиться в различных сочетаниях друг с другом как в пределах одного бронха, так и в разных участках лёгкого. Иногда они отделены друг от друга участками нормального эпителия бронхов. БКГ и ПМ могут наблюдаться как изолированно, так и в сочетании друг с другом. Таким образом, выделяют несколько вариантов предопухолевых изменений в зависимости от их сочетания друг с другом: изолированная БКГ (иБКГ); БКГ, сочетающаяся с ПМ (пмБКГ), ПМ; сочетающаяся с БКГ (бкгПМ); ПМ, сочетающаяся с дисплазией (дПМ); дисплазия (Панкова и др., 2014; Pancova et al., 2016).
Стабильность таких предопухолевых изменений находит подтверждение в их специфических функциональных характеристиках. Так, экспрессия белков p53, Ki-67, Bcl-2 и CD138 различна в предопухолевых изменениях в зависимости от их сочетания друг с другом (Панкова и др., 2010; Pancova et al., 2016). Кроме того, наличие различных вариантов предопухолевых
изменений ассоциировано с прогрессией НМРЛ. Наличие изолированной БКГ в мелких бронхах больных с НМРЛ связано с высокой частотой гематогенного метастазирования (неопубликованные данные), а сочетание БКГ и ПМ - с повышенной вероятностью рецидивирования заболевания (Pancova et al., 2016).
Таким образом, изолированные и сочетанные варианты бронхиальных изменений отражают различные стадии последовательного или прерывистого предопухолевого процесса в респираторном эпителии. В соответствии с этим, представляется интересным оценка экспрессионного профиля данных морфологических изменений и поиск их специфических генов (транскриптов), что позволит в дальнейшем найти молекулярно-генетические механизмы, лежащие в основе прогрессии или реверсии предопухолевого процесса.
Цель исследования: изучение транскриптома эпителия бронхов на каждом этапе предопухолевого процесса и поиск молекулярно-генетических маркеров, специфически экспрессирующихся в различных бронхиальных изменениях.
Задачи:
1. Идентифицировать гены, специфические для каждого из предопухолевых изменений эпителия бронхов.
2. Описать биологические процессы и сигнальные пути, характерные для каждого типа предопухолевых изменений эпителия бронхов.
3. Валидировать экспрессию специфических генов на белковом уровне в различных предопухолевых изменениях эпителия бронхов.
4. Оценить особенности локализации белковой экспрессии в пределах эпителия бронхов с различными морфологическими изменениями.
Работа была выполнена на базе НИИ онкологии Томского НИМЦ под руководством старшего научного сотрудника лаборатории молекулярной онкологии и иммунологии Томского НИМЦ, доцента кафедры органической химии ТГУ, кандидата биологических наук Денисова Евгения
Владимировича.
Канцерогенез в лёгком представляет собой сложный многоступенчатый процесс последовательного накопления генетических и молекулярных нарушений, идущего параллельно с морфологическими изменениями от нормального эпителия через базальноклеточную гиперплазию (БКГ), плоскоклеточную метаплазию (ПМ), дисплазии (I-III степени) к карциноме in situ (CIS) и инвазивному раку (Kadara et al.,2014; Панкова и др., 2014). Предопухолевый процесс может быть как последовательным (как описано выше), так и прерывистым, когда возможна остановка процесса на любом из морфологических изменений бронхиального эпителия. Доказательством этого свидетельствует тот факт, что вышеперечисленные морфологические изменения могут встречаться в бронхиальном эпителии больных немелкоклеточным раком легкого (НМРЛ) (Kadara et al., 2016). Более того, морфологические изменения эпителия могут находиться в различных сочетаниях друг с другом как в пределах одного бронха, так и в разных участках лёгкого. Иногда они отделены друг от друга участками нормального эпителия бронхов. БКГ и ПМ могут наблюдаться как изолированно, так и в сочетании друг с другом. Таким образом, выделяют несколько вариантов предопухолевых изменений в зависимости от их сочетания друг с другом: изолированная БКГ (иБКГ); БКГ, сочетающаяся с ПМ (пмБКГ), ПМ; сочетающаяся с БКГ (бкгПМ); ПМ, сочетающаяся с дисплазией (дПМ); дисплазия (Панкова и др., 2014; Pancova et al., 2016).
Стабильность таких предопухолевых изменений находит подтверждение в их специфических функциональных характеристиках. Так, экспрессия белков p53, Ki-67, Bcl-2 и CD138 различна в предопухолевых изменениях в зависимости от их сочетания друг с другом (Панкова и др., 2010; Pancova et al., 2016). Кроме того, наличие различных вариантов предопухолевых
изменений ассоциировано с прогрессией НМРЛ. Наличие изолированной БКГ в мелких бронхах больных с НМРЛ связано с высокой частотой гематогенного метастазирования (неопубликованные данные), а сочетание БКГ и ПМ - с повышенной вероятностью рецидивирования заболевания (Pancova et al., 2016).
Таким образом, изолированные и сочетанные варианты бронхиальных изменений отражают различные стадии последовательного или прерывистого предопухолевого процесса в респираторном эпителии. В соответствии с этим, представляется интересным оценка экспрессионного профиля данных морфологических изменений и поиск их специфических генов (транскриптов), что позволит в дальнейшем найти молекулярно-генетические механизмы, лежащие в основе прогрессии или реверсии предопухолевого процесса.
Цель исследования: изучение транскриптома эпителия бронхов на каждом этапе предопухолевого процесса и поиск молекулярно-генетических маркеров, специфически экспрессирующихся в различных бронхиальных изменениях.
Задачи:
1. Идентифицировать гены, специфические для каждого из предопухолевых изменений эпителия бронхов.
2. Описать биологические процессы и сигнальные пути, характерные для каждого типа предопухолевых изменений эпителия бронхов.
3. Валидировать экспрессию специфических генов на белковом уровне в различных предопухолевых изменениях эпителия бронхов.
4. Оценить особенности локализации белковой экспрессии в пределах эпителия бронхов с различными морфологическими изменениями.
Работа была выполнена на базе НИИ онкологии Томского НИМЦ под руководством старшего научного сотрудника лаборатории молекулярной онкологии и иммунологии Томского НИМЦ, доцента кафедры органической химии ТГУ, кандидата биологических наук Денисова Евгения
Владимировича.
Проблема поиска маркеров прогрессии предопухолевых состояний и выбор соответствующей тактики лечения пациентов чрезвычайно актуальна на данный момент. В 2016 году был анонсирован мультидисциплинарный и межинститутский проект Атлас генома предрака (Pre-Cancer Genome Atlas (PCGA)), который сосредоточен на поиске молекулярно-генетических нарушений в предопухолевых изменениях и особенностей их микроокружения, ассоциированных с формированием инвазивного рака (Campbell et al. 2016a). Уже сейчас имеются предварительные данные о том, что предопухолевые изменения эпителия бронхов могут быть подразделены на шесть подтипов, различающихся по вероятности прогрессии в рак (Beane et al., 2017). Кроме того, идентифицированы гены, микроРНК и сигнальные пути, вовлеченные в прогрессирование предопухолевых изменений (Campbell et al., 2016). Но, не смотря на все эти данные, пока не существует маркеров, с помощью которых, возможно было бы оценивать риск прогрессии морфологических изменений эпителия бронхов в рак.
На наш взгляд, эффективными моделями для поиска маркеров прогрессии предопухолевого процесса могут быть морфологические изменения эпителия бронхов, представленные в изолированном виде или в сочетании с друг с другом. Фактически, такие варианты бронхиальных изменений представляют стадии предопухолевого процесса. При этом, у части людей данный процесс остановился на стадии БКГ, тем самым, в бронхах таких лиц находят изолированную БКГ. У других людей БКГ прогрессирует в ПМ. Соответственно, в респираторном эпителии этих людей обнаруживается сочетание БКГ и ПМ. У этой же категории людей, вероятно, ПМ не способна прогрессировать в дисплазию. Тогда как у других лиц, у которых находят сочетание ПМ с дисплазией, метаплазия обладает потенциалом для диспластической трансформации.
Проведенное исследование позволяет заключить, что экспрессионный профиль БКГ зависит от того, сочетается она с ПМ или нет. Аналогичным 52
образом транскрипционный профиль ПМ зависел от её сочетания с БКГ или дисплазией. Для каждого из вариантов сочетаний морфологических изменений бронхиального эпителия были описаны дифференциально гипер- или гипоэкспрессирующиеся гены. Кроме того, для каждого варианта бронхиальных изменений были найдены специфические гены; экспрессия части из них была валидирована белковом уровне. Описанные специфические маркеры каждых из изменений могут представлять большую диагностическую ценность в оценке риска прогрессирования предопухолевого процесса в бронхиальном эпителии.
На наш взгляд, эффективными моделями для поиска маркеров прогрессии предопухолевого процесса могут быть морфологические изменения эпителия бронхов, представленные в изолированном виде или в сочетании с друг с другом. Фактически, такие варианты бронхиальных изменений представляют стадии предопухолевого процесса. При этом, у части людей данный процесс остановился на стадии БКГ, тем самым, в бронхах таких лиц находят изолированную БКГ. У других людей БКГ прогрессирует в ПМ. Соответственно, в респираторном эпителии этих людей обнаруживается сочетание БКГ и ПМ. У этой же категории людей, вероятно, ПМ не способна прогрессировать в дисплазию. Тогда как у других лиц, у которых находят сочетание ПМ с дисплазией, метаплазия обладает потенциалом для диспластической трансформации.
Проведенное исследование позволяет заключить, что экспрессионный профиль БКГ зависит от того, сочетается она с ПМ или нет. Аналогичным 52
образом транскрипционный профиль ПМ зависел от её сочетания с БКГ или дисплазией. Для каждого из вариантов сочетаний морфологических изменений бронхиального эпителия были описаны дифференциально гипер- или гипоэкспрессирующиеся гены. Кроме того, для каждого варианта бронхиальных изменений были найдены специфические гены; экспрессия части из них была валидирована белковом уровне. Описанные специфические маркеры каждых из изменений могут представлять большую диагностическую ценность в оценке риска прогрессирования предопухолевого процесса в бронхиальном эпителии.
