АННОТАЦИЯ 3
Перечень сокращений 4
Введение 5
Основная часть 7
1 Обзор литературы 7
1.1 Инверсионный полиморфизм малярийных комаров 7
1.1.1 Инверсионный полиморфизм и видообразование 11
1.1.2 Инверсионный полиморфизм Anopheles messeae 11
1.2 Пространственная организация ядра 16
1.2.1 Модель CT-IC организации ядра 18
1.3 Пространственная организация ядер клеток малярийных комаров 20
2 Материалы и методы 27
2.1 Материалы 27
2.2 Методы 28
2.2.1 Видовая идентификация вида Anopheles messeae с помощью ПЦР-ПДРФ анализа . 28
2.2.2 Гель-электрофорез 29
2.2.3 Приготовление суховоздушных препаратов политенных хромосом слюнных желёз
Anopheles messeae 29
2.2.4 Приготовление меченных ДНК-зондов микродиссекционной пробы 1C Х-
хромосомы и целой Х-хромосомы Anopheles messeae 30
2.2.5 2D Флуоресцентная in situ гибридизация с хромосомами слюнных желез
Anopheles messeae (2D FISH) 31
2.2.6 Лактоацетоорсеинновое окрашивание препаратов политенных хромосом 32
2.2.7 3D Флуоресцентная in situ гибридизация с трофоцитами яичников /
мальпигиевыми сосудами Anopheles messeae (3D FISH) 32
3 Результаты и обсуждение 34
3.1 Видовая идентификация комаров Anopheles messeae 35
3.1.1 Видовая идентификация для физического картирования районспецифичной ДНК-
пробы 1С Х-хромосомы Anopheles messeae на хромосомной карте клеток слюнных желез Anopheles messeae 35
3.1.2 Видовая идентификация для определения пространственного расположения
района 1С Х-хромосомы Anopheles messeae относительно центромерного и теломерного районов в ядрах клеток мальпигиевых сосудов Anopheles messeae 37
3.1.3 Приготовление давленных препаратов хромосом слюнных желез из личинок
Anopheles messeae и их кариотипирование с целью отбора особей с генотипом X11 38
3.2 Флуоресцентная in situ гибридизация микродиссектированной ДНК-пробы 1C
Anopheles messeae c хромосомами слюнных желёз Anopheles messeae 39
3.3 Определение пространственного расположения района 1С Anopheles messeae относительно центромерного, теломерного районов и 2B-C в ядрах трофоцитов яичников и клеток мальпигиевых сосудов Anopheles messeae (генотип X11) с помощью 3D-FISH ...40
3.4 Анализ тканеспецифических особенностей пространственного расположения района 1С Х-хромосомы Anopheles messeae (генотип X11) и межвидовых различий с пространственным расположением района 3С Х-хромосомы Anopheles atroparvus в ядрах
трофоцитов яичников и клеток мальпигиевых сосудов 43
Выводы 46
Список использованной литературы 47
Приложение А 57
Считается, что разнообразие живых организмов определяется разнообразием генов. В последние десятилетия благодаря геномным проектам было показано, что даже эволюционно далекие организмы почти не отличаются кодирующими белки генами. Таким образом, по крайней мере межвидовые различия определяются не столько различием в структуре генов, сколько в их активности. «Эпигенетические» механизмы регуляции экспрессии генов, которые могли быть связаны с видообразованием, в настоящее время изучены слабо. Пространственное положение генов, особенно в ядрах клеток зародышевого пути, потенциально может определять развитие организма и служить фактором видообразования, особенно в сочетании со структурными перестройками генома. Эволюция малярийных комаров сопровождается интенсивными перестройками Х-хромосомы - инверсиями, которые могут быть связаны с видообразованием, вызывая мутации в точках разрывов, снижая рекомбинацию генов в инвертированных районах или путем изменения их пространственного расположения в ядрах клеток генеративной системы.
В последнее время наблюдается прорыв в изучение пространственной организации хромосом благодаря развитию микроскопии (3D-FISH) и подходах, основанных на полногеномном секвенировании (ChIP, DamID, Hi-C). Эти подходы позволяют с высоким разрешением определять какие гены, геномные домены или хромосомы связаны с белками, активирующими или подавляющими работу генов. Данные о геномах многих видов малярийных комаров доступны и позволяют применять эти методы для изучения эволюции видов.
Данная работа посвящена определению пространственного расположения района 1С Х-хромосомы Anopheles messeae, гомейологичного 3С Anopheles atroparvus, и определению наличия контакта района 1С Х-хромосомы с ядерной оболочкой в трофоцитах и клетках мальпигиевых сосудов несмотря на то, что локализован дистальнее района 3С An. atroparvus. С помощью иммуноокрашивания хроматина антителами к белку ядерной оболочки (ламину B) были выявлены районы Х-хромосомы An. atroparvus, потенциально взаимодействующие с ядерной оболочкой ядер трофоцитов яичников. С помощью 3D-FISH показано, что, действительно, у этого вида район 3С расположен ближе к ядерной оболочке в трофоцитах по сравнению с центромерным и теломерным районами. Работа направлена на поиск видоспецифичных особенностей пространственной организации хромосом, которые могут быть связаны с видообразованием у малярийных комаров, принадлежащих подгруппе Maculipennis.
Цель: Определить пространственное расположение района 1С Х-хромосомы малярийного комара Anopheles messeae (генотип Х11) в ядрах трофоцитов яичников и клеток мальпигиевых сосудов Anopheles messeae.
Задачи:
1. Проведение видовой идентификации и кариотипирования комаров с целью отбора особей Anopheles messeae с генотипом X11;
2. Физическое картирование районспецифичной ДНК-пробы 1С Х-хромосомы Anopheles messeae на хромосомной карте клеток слюнных желез Anopheles messeae с помощью FISH;
3. Определение пространственного расположения района 1С Х-хромосомы Anopheles messeae относительно центромерного, теломерного районов и 2В-С в ядрах трофоцитов яичников и клеток мальпигиевых сосудов Anopheles messeae (генотип X11) с помощью 3D-FISH;
4. Анализ тканеспецифических особенностей пространственного расположения района 1С Х-хромосомы Anopheles messeae (генотип X11) и межвидовых различий с пространственным расположением района 3С Х-хромосомы Anopheles atroparvus в ядрах трофоцитов яичников и клеток мальпигиевых сосудов.
Работа проводилась в лаборатории экологии, генетики и охраны окружающей среды НИ ТГУ.
1. С помощью 3D FISH проведён анализ пространственного расположения района 1С Х-хромосомы Anopheles messeae в ядрах трофоцитов яичников и клеток мальпигиевых сосудов Anopheles messeae (генотип X11). Определено, что район 1С Х-хромосомы Anopheles messeae локализуется на периферии клеточных ядер как трофоцитов, так и клеток мальпигиевых сосудов, что соответствует данным о положении гомейологичного района 3С Х-хромосомы Anopheles atroparvus;
2. Исходя из полученных данных относительно положения Х-хромосомы Anopheles messeae в пространстве ядер трофоцитов и клеток мальпигиевых сосудов выделены группы А и В. Для обоих групп характерно равноудалённое по всей длине расположение хромосомы в непосредственной близости от ядерной оболочки с тем отличием, что у хромосом группы А теломерный и цетромерный районы располагаются предельно далеко друг от друга, когда как у хромосом группы В эти районы в разной степени сближены;
3. Выявлены тканеспецифические особенности в положении Х-хромосомы в пространстве ядер трофоцитов и клеток мальпигиевых сосудов Anopheles messeae. Для трофоцитов характерна наибольшая частота ядер с изгибом Х-хромосомы в пределах 61-120°, тогда как для клеток мальпигиевых сосудов в пределах 121-180°. Сравнение с данными по локализации Х-хромосомы Anopheles atroparvus в ядрах трофоцитов и клеток мальпигиевых сосудов показало схожесть в распределении углов изгиба Х-хромосомы;
4. Выявлены межвидовые различия в положении Х-хромосомы в пространстве ядер трофоцитов и клеток мальпигиевых сосудов у Anopheles messeae и Anopheles atroparvus. У Х-хромосомы Anopheles atroparvus теломерный и центромерный районы направлены к центру ядра, тогда как у Anopheles messeae вся Х-хромосома расположена на периферии ядра.
