АННОТАЦИЯ 2
ВВЕДЕНИЕ 3
1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 5
1.1 Основные компоненты очагов 5
1.1.1 Иксодовые клещи - переносчики инфекции 5
1.1.2 Вирус клещевого энцефалита 14
1.1.3 Иксодовый клещевой боррелиоз 18
1.1.4 Прокормители 20
1.2 Микробиом иксодовых клещей р. Ixodes и Dermacentor 22
1.3 Методы изучения разнообразия микроорганизмов 23
1.3.1 Классические методы секвенирования 24
1.3.2 Методы секвенирования второго поколения 25
1.3.3 Методы секвенирования третьего поколения 28
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 31
2.1 Подготовка библиотеки образцов, содержащих ДНК, для секвенирования 31
2.2 Электрофоретическое разделение нуклеиновых кислот в агарозном геле 33
2.3 Очищения образцов, содержащих амплифицированные фрагменты 16з-рРНК 34
2.4 Определение степени чистоты и концентрации нуклеиновых кислот 35
2.5 Секвенирование подготовленной библиотеки образцов, содержащих ДНК 36
2.6 Обработка данных после секвенирования с помощью биоинформатических методов 37
3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 38
3.1 Библиотека образцов для секвенирования 38
3.2 Обработка и анализ результатов секвенирования 40
3.3 Заключение 50
ВЫВОДЫ 52
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 53
ПРИЛОЖЕНИЕ А 63
ПРИЛОЖЕНИЕ Б 74
Клещи являются облигатными кровососущими эктопаразитами, которые обеспечивают передачу патогенов человека и животных во всем мире и являются одним из компонентов очагов клещевых трансмиссивных инфекций, к которым принадлежат вирусные инфекции (клещевой энцефалит, Омская геморрагическая лихорадка, лихорадка Кемерово и др.), бактериальные инфекции (иксодовые клещевые боррелиозы, риккетсиозы группы клещевой пятнистой лихорадки, анаплазмоз, эрлихиоз и др.) и протозойные инфекции (бабезиоз). Определение видового разнообразия непатогенной микробиоты кишечника клеща, его расшифровка и установление взаимодействий между организмом клеща и его симбиотическими бактериями являются стратегическим важными направлениями в борьбе с клещевыми заболеваниями.
Клещи являются хозяевами большого числа видов бактерий, чем любая другая группа кровососущих членистоногих, которых они получают либо из окружающей среды, либо за счет питания на млекопитающих и человеке, либо наследуют их по материнской линии, и являются основным источником как установленных, так и возникающих зоонозных заболеваний (Bonnet et al., 2017). Важность изучения видового разнообразия непатогенной микробиоты кишечника клещей, на мой взгляд, позволит внести весомый вклад в объяснение следующих открытых вопросов: 1) Как непатогенная микробиота кишечника членистоногих-переносчиков участвует в передаче патогенных микроорганизмов клещами позвоночным животным и человеку?; 2) Как определение видового разнообразия непатогенной микробиоты повлияет на изучение взаимоотношений между организмом клеща и патогенными и непатогенными микроорганизмами, и как эта информацию повлияет на разработку стратегии борьбы как с клещами, так и с клещевыми трансмиссивными инфекциями?; 3) Как исследование микробных сообществ клеща позволит препятствовать передаче патогенных микроорганизмов, и как они претерпели эволюционные сдвиги, позволившие им внедрятся в организм клещей и закрепляться в нем.
В основе изучения видового разнообразия микроорганизмов лежит определение вида микроорганизма по гену бактериальной 16з-рРНК. Этот ген содержит девять «гипервариабельных областей» (V1-V9), каждая из которых строго индивидуальна для разных видов бактерий (Van de Peer et al., 1996) и эти области фланкированы консервативными участками, которые постоянны для большинства видов бактерий, что позволяет использовать универсальные праймеры для амплификации гипервариабельных областей (McCabe et al., 1999; Lu et al., 2000; Baker et al., 2003; Munson et al., 2004), что позволяют достаточно точно выделять и выявлять необходимые виды бактерий среди их различных видов и родов (Choi et al., 1996; Marchetti et al., 1998; Lu et al., 2000; Bertilsson et al., 2002; Rothman et al., 2002; Clarridge, 2004; Becker et al., 2004; Maynard et al., 2005; Chakravorty et al., 2008).
Цель научно-исследовательской работы - оценка видового разнообразия непатогенной микробиоты кишечника клещей видов Ixodes persulcatus, Ixodes pavlovskyi и Dermacentor reticulatus.
Задачи:
1. Подготовить библиотеки ДНК, выделенной из образцов клещей I. pavlovskyi, I. persulcatus и D. reticulatus.
2. Проведение секвенирования подготовленной библиотеки ДНК на секвенаторе MinION Mk1B Oxford Nanopore.
3. Обработка и анализ полученных данных секвенирования.
Работа была выполнена на базе НИИ биологии и биофизики ТГУ в лаборатории экологии, генетики и охраны окружающей среды ТГУ под руководством канд. биол. наук, доценту Коханенко А.А. За помощь в выборе темы и консультаций в ходе написания работы я благодарен своему научному руководителю канд. биол. наук, доценту А.А. Коханенко. За помощь и консультации по обработке данных я благодарен аспиранту К. М. Кириленко и канд. биол. наук, доценту И.Б. Бабкиной.
1. Подготовлены 5 ДНК библиотек микробиоты кишечников клещей I. pavlovskyi, I. persulcatus, D. reticulatus и с помощью секвенирования на секвенаторе MINION (Oxford nanopore) проведен анализ видового разнообразия микробиоты полученных образцов.
2. Обработка данных секвенирования при помощи пакета «phyloseq» в приложении RStudio показала, что микробиом кишечника клеща D. reticulatus наименее разнообразен (3 вида, 3 рода и 3 семейства) по сравнению с I. persulcatus(2572 вида, 354 рода и 112 семейств) и I. pavlovskyi (2352 вида, 414 родов, 107 семейств).
3. Показано, что преобладающими для D. reticulatus являются бактерии вида Francisella persica, для I. persulcatus - Haemophilus piscium, и для I. pavlovskyi -Rickettsia bellii; преобладающими родами являются Francisella для D. reticulatus, Aeromonas и Nitrosomonas для I. persulcatus и Rickettsia для I. pavlovskyi; преобладающими семействами являются Francisellaceae для D. reticulatus, Rickettsiaceae для I. pavlovskyi и Aeromonadaceae для I. persulcatus.
