АННОТАЦИЯ 3
Перечень условных обозначений, сокращений, символов, терминов 2
Введение 3
1 Обзор литературы 5
1.1 Общие сведения о раке 5
1.2 Внутриопухолевая гетерогенность 6
1.2.1 Определение внутриопухолевой гетерогенности 6
1.2.2 Модели формирования внутриопухолевой гетерогенности 7
1.3 Клеточная пластичность 8
1.4.1 Внутриопухолевая гетерогенность злокачественных опухолей молочной железы ....11
1.5 Стволовые клетки 11
1.5.1 Стволовые клетки в нормальных тканях 11
1.5.2 Раковые стволовые клетки 12
1.5.3 Особенности опухолевых стволовых клеток 14
1.5.4 Функции основных маркерных белков раковых стволовых клеток 17
1.6 CD44 19
1.6.2 Функции белка CD44 21
1.6.5 Влияние CD44 на протекание рака 22
1.7 Система CRISPR/Cas 23
Выводы 26
Список литературы 27
Злокачественные новообразования (ЗНО) занимают лидирующие позиции среди причин человеческой смертности. Несмотря на определенные успехи в области терапии ЗНО, появление метастазов, а также рецидивы в пораженных органах остаются одной из основных причин смерти пациентов с онкологическими заболеваниями [Циркулирующие опухолевые клетки и циркулирующие раковые стволовые..., 2021 ].
В раковых опухолях присутствуют стволовые клетки, представляющие собой популяцию неопластических клеток, которые способны в течение длительного времени размножаться для поддержания роста инвазивной солидной опухоли. Такие клетки обладают способностью к самообновлению и дают начало новым линиям раковых клеток, обуславливая гетерогенность опухоли [Циркулирующие опухолевые клетки и циркулирующие раковые стволовые., 2021]. Стволовые опухолевые клетки (ОСК) являются инициаторами рецидивов, что делает их важной мишенью для разработки новых методов лечения [Пучинская, 2016]. Согласно современным представлениям, ОСК могут образовываться из дифференцированных опухолевых клеток в результате их дедифференцировки. Важно отметить, что данный процесс лежит в основе формирования метастазов [Merrell, Stanger, 2016]. Способность к данному переходу обусловлена стволовой пластичностью раковых клеток [Hanahan, 2022]. В связи с этим, ингибирование способности метастатической раковой клетки (микрометазстаза) к дедифференцировке является перспективным подходом для предотвращения развития метастатической болезни [Prevention of Metastasis by Suppression., 2024]. Для исследования потенциальных лекарственных препаратов, направленных на подавление дедифференцировки, удобным подходом может стать использование линии раковых клеток, которые при переходе в состояние стволовой раковой клетки приобретали бы явные фенотипические отличия от дифференцированных клеток, например, начинали бы флуоресцировать.
Фенотипическое отличие ОСК от основной массы опухолевых клеток - экспрессия поверхностных специфичных маркеров. Для идентификации данной популяции существуют определенные маркеры, например, CD44. CD44 выявляется на ОСК при раке молочной, предстательной и поджелудочной желез, печени, колоректальном раке, опухолях головы и шеи, желудка, легких, шейки матки, яичников, нейробластоме [Циркулирующие опухолевые клетки и циркулирующие раковые стволовые., 2021].
Цель работы - получить генетически модифицированную линию клеток рака молочной железы, продуцирующих зеленый флуоресцентный белок (EGFP) при экспрессии гена CD44 в клетках.
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
1. Выполнить дизайн донорной плазмиды для получения линий клеток рака молочной железы человека, транскрибирующих продукт гена CD44 в виде единой мРНК с зеленым флуоресцентным белком (EGFP).
2. Провести генетическую модификацию клеточных линий рака молочной железы человека T47D, MDA-MB-231 и BT474 с применением технологии CRISPR/Cas9 редактирования генома.
3. Провести селекцию трансфецированных клеток для получения поликлональных линий клеток рака молочной железы человека, транскрибирующих продукт гена CD44 в виде единой мРНК с зеленым флуоресцентным белком (EGFP), но транслирующих CD44 и EGFP в форме отдельных белков.
Работа выполнена на базе центра Биологических исследований и биоинженерии ЦНИЛ СибГМУ под руководством заведующего центром, канд. биол. наук Александры Геннадьевны Першиной.
1. Выполнен дизайн двух рекомбинантных плазмидных ДНК, одна из которых кодирует компоненты комплекса CRISPR/Cas9, направляемого к 18 экзону гена CD44, - pX458_CD44_Pur, а вторая является донорной конструкцией, обеспечивающей встраивание гена зеленого флуоресцентного белка EGFP с C-конца гена CD44, -
pCD44_T2A_EGFP_NEO_Pur.
2. Проведена трансформация клеток E. coli и выделено 13,5 мкг и 11 мкг плазмидных ДНК pX458_CD44_Pur и pCD44_T2A_ECFP_NEO_Pur. Плазмиды предназначены длятрансфекции линий клеток рака человека.
3. Определена действующая концентрация генетицина для селекции генетически модифицированных клеток, она составила для клеток линии T47D - 500 мкг/мл, MDA-MB- 231 - 700 мкг/мл, BT474 - 500 мкг/мл.
4. В результате ко-трансфекции клеток 293 T донорной плазмидной ДНК, кодирующей продукт гена CD44 совместно с EGFP, и плазмидной ДНК, кодирующей CRISPR/Cas9, показано, что рекомбинантные плазмиды экспрессионно-активны, эффективность трансфекции клеток линии 293T составила 22,11 ± 0,11 %, T47D - 4,30 ± 0,06 %, MDA-MB-231 - 1,86 ± 0,09 %, BT474 - 2,10 ± 0,06 %.
5. Выполнена селекция и получены поликлональные клеточные линии T47D_CD44, MDA-MB-231 и BT474_CD44, транскрибирующие продукт гена CD44 в виде единой мРНК с зеленым флуоресцентным белком (EGFP), но транслирующие белок CD44 и белок EGFP в форме отдельных белков. С помощью метода ПЦР-анализа подтверждено успешное встраивание трасгена в геномную ДНК и подтверждено получение генетически модифицированной клеточной линии T47D-CD44.
