ВВЕДЕНИЕ 3
1 ЭУКАРИОТЫ И ПРОКАРИОТИЧЕСКИЕ МИКРООРГАНИЗМЫ В ЭКСТРЕМАЛЬНЫХ МЕСТООБИТАНИЯХ 4
1.1 Экстремальные факторы среды и организмы-экстремофилы 4
1.2 Прокариоты в экосистемах с экстремальными физико-химическими параметрами среды 4
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 8
2.1 Объекты исследования 8
2.2 Использованные молекулярно-биологические методы 9
2.2.1 Выделение тотальной ДНК 9
2.2.2 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) для амплификации фрагментов гена 188рРНК 10
2.2.3 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) для амплификации фрагментов гена168
рРНК 11
2.2.4 Детекция результатов ПЦР 12
2.2.5 Разделение фрагментов генов в денатурирующем градиентном гель- электрофорезе 12
З РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 14
3.1. Доминирующие эукариоты из микробных обрастаний, ассоциированных с
горячим источником в Забайкалье 14
3.2. Доминирующие эукариоты из почв в местах горения угольных отвалов в Забайкалье и Кемеровской области 18
3.3 Доминирующие прокариоты из микробных обрастаний и воды геотермальной
скважины в Забайкалье 22
3.4 Доминирующие прокариоты в накопительных культурах из геотермальных
местообитаний 30
4 ВЫВОДЫ 38
5 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 39
Разнообразие живых организмов на Земле долгое время недооценивалось. Истинные масштабы разнообразия «приоткрылись» с развитием молекулярных методов, основанных на исследовании нуклеиновых кислот (ДНК). Они позволяют оценить разнообразие живых организмов в природном образце и определить доминирующих представителей.
Почва угольных отвалов и микробные обрастания в местах стоков шахтных вод и геотермальных источниковотносятсяк экстремальным местообитаниям.Они характеризуются высоким содержанием металлов, зачастую имеют низкийpH и высокую температуру. К настоящему времени показано, что многие представители прокариот населяют подобные экосистемы. Но лишь единичные сообщения посвящены детекцииэукариотических организмов в пробах, отобранных в средах с экстремальными условиями.В связи с непол- нойизученностьюраспространения и метаболического потенциала эукариот и прокариот экосистем с экстремальными физико-химическими факторамиактуальны исследования, направленные на расширение знаний об экологии и физиологии этих организмов.
Целью работы была молекулярная детекция доминирующих филотипов эукариот и прокариот в почвах угольных отвалов и микробных обрастаний, а также накопительных культур из геотермальной скважины. В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:
1. Выделить тотальную ДНК из проб почв и микробных матов;
2. Амплифицировать фрагменты гена 188рРНКдляэукариот и гена 168рРНКдля прокариот;
3. Разделить фрагменты в химическом денатурирующем градиенте и получить ДГГЭ- профили доминирующих микроорганизмов;
4. Идентифицировать доминирующих Eukaryota и Bacteria в исследованных пробах на основе анализа полученных последовательностей.
1. Из природных образцов, отобранных в местах горения угольных отвалов ив микробных обрастанияхгеотермальных вод в Забайкалье и Кемеровской области,а также из исследуемых накопительных культур выделена тотальная ДНК.
2. Амплифицированны фрагменты гена 188рРНКдлиной около 500 п.н. и фрагменты гена 168рРНКдлиной около 600 п.н., получены ДГГЭ-профили доминирую- щихEukaryota и Bacteria.
3. В почвах угольных отвалов в Кемеровской области и Алтайском крае обнаружены филотипы мохообразных, близкородственных Ceratodonpurpureus (степень гомологии частичной последовательности гена 188рРНК 99%), и грибы (95-99% сходства последовательности с Malasseziarestricta).
4. В образцах микробных обрастаний, связанных с горячим источником в Забайкальском крае, детектированыфилотипы, соответствующие микроводорослям (гомология 97-99%), и филотип, близкородственный коловратке Lecaneleontina(99°/o).
5. В микробных обрастаниях и водах геотермальной скважины в Забайкалье обнаружены филотипыфирмикут, дальнородственных Fusibacterfontis и Dialisterpneu- mosintes (степень гомологии частичной последовательности гена 168рРНК 91-99 %), клостридий, родственных Proteiniclasticumruminis и Clostridiumsticklandii (99 и 96 %), цианобактерий, близкородственных Scytonemaarcangelii, Fischerellather- malisPCC 7521, Mastigocladuslaminosus (98 и 99%), и аэромонад (90-99% сходства последовательности с Aeromonashydrophila).
6. В накопительных культурах обнаружены филотипы, соответствующие сульфатре- дукторам Desulfotomaculumprofundi (гомология частичной последовательности гена 168рРНК 99%); филотип, дальнородственный спирохе- 'dFevinemaanders(>niiC''66 (82-83%), и филотипы пропионовокислых бактерий, близкородственные CutibacteriumacnesDCW_SL_3 (99 %).
Таким образом, в исследованных местообитаниях были обнаружены организмы, филогенетически удаленные от валидно описанных представителей. Поэтому, изученные экосистемы служат перспективными источниками для выделения новых организмов.
